RNA提取及常见失败原因.ppt

研究基因的表达和调控时 需要从组织或细胞中分离纯化RNA RNA质量的高低常常影响RT PCR cDNA库构建和NorthernBlot等分子生物学实验的成败 Trizol是一种新型总RNA抽提试剂 内含异硫氰酸胍等物质 能迅速破碎细胞 抑制细胞释放出的核酸酶 目的 主要试剂 1 Trizol试剂含有苯酚 具有毒性和刺激性 注意操作 2 RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉 注意配带手套 样品尽可能盖严 3 细胞裂解必需充分且操作迅速 裂解不完全会降低最后得率 因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中 细胞裂解之后要看不见颗粒状物质 结缔组织和骨除外 在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作 防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA 4 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构 可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡 使细胞裂解充分 2 8 避光保存一年 准备工作 RNA酶 Rnase 是导致RNA降解最主要的物质 此酶非常稳定 在一些极端的条件下只可暂时失活 但限制因素去除后又迅速恢复活性 常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活 1 它广泛存在于人的皮肤上 因此制备RNA时必须戴手套 2 RNase的又一污染源是取液器 根据取液器制造商的要求对取液器进行处理 一般情况下采用以DEPC配制的70 乙醇擦洗取液器的内部和外部 可基本达到要求 3 塑料制品 玻璃和金属物品的处理 1 塑料制品 尽量使用一次性无菌塑料制品 已标明RNase free的塑料制品 如没有开封使用过 通常不必再处理 处理的步骤如下 在玻璃烧杯中注入去离子水 加入DEPC使其终浓度为0 05 0 1 DEPC H2O DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物 须在通风橱中小心使用 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中 注入DEPC H2O 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中 在通风柜中37 或室温下处理过夜 将DEPC H2O小心倒入废液瓶中 将装有DEPC H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口 高温高压蒸汽灭菌至少30分钟 灭菌塑料制品烘烤干燥 置洁净处备用 2 玻璃和金属物品250 烘烤3小时以上 DEPC是RNA酶的化学修饰剂 它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性 DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物 因而使用时需小心 试验所用试剂也可用DEPC处理 加入DEPC至0 1 浓度 然后剧烈振荡10分钟 再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC 否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性 但DEPC能与胺和巯基反应 因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理 DEPC 二乙基焦碳酸酯 实验步骤如下 1 取50 100mg的组织 加入1mlTrizol试剂 用匀浆器打匀 Trizol先放于冰上 2 将匀浆室温放置5min 3 加入200 l氯仿 剧烈震荡混匀30s 冰上静置3min 4 12000rpm 4 离心15min 5 将上清液小心转移到新的1 5ml离心管中 取400 l 加入等量体积的异丙醇 上下颠倒几次混匀 室温下放置15min 此步中注意 不要吸取任何中间层物质 宁缺勿烂 6 12000rpm 4 离心15min 7 小心移去上清液 防止RNA沉淀丢失 8 用70 乙醇 DEPC处理的水配制 洗涤1次 加入700 l乙醇 将RNA沉淀弹起 漂洗 此时RNA是不溶解的 9 8000rpm 室温离心10min 10 尽可能彻底地吸走上清 防止RNA沉淀丢失 11 真空离心干燥3 5分钟 或放在室温下使乙醇完全挥发掉 12 沉淀用30 lDEPC H2O溶解 如发现沉淀难溶 68 处理10min 13 RNA检测 1 测定样品在260nm和