RNA干扰完整解析.ppt

RNA的干扰 RNA的干扰 RNA干扰是什么 RNA干扰的发现 RNA干扰的作用机制 RNA干扰的应用 RNA干扰存在的问题 什么是RNA干扰 英文 RNAinterference 缩写RNAi 概念 是指在进化过程中高度保守的 由双链RNA double strandedRNA dsRNA 诱发的 同源mRNA高效特异性降解的现象 是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象 RNA干扰的发现 2006年 安德鲁 法厄与克雷格 梅洛 CraigC Mello 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖 1995 1992 1991 1990 Napoli等尝试在有颜色的矮牵牛 Petuniahybrida 花翼瓣中通过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表达 来加深花瓣的颜色 出人意料的是 花瓣颜色不仅未加深 而且42 的介入CHS基因的植物的花全部变白或有白色或灰白图案 Fire等把RNA注入新秀杆线虫以控制基因的表达 Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象 罗马诺 Romano 和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达 2002 2000 1999 1998 美国华盛顿卡耐基研究院的Fire等在研究RNA干扰所需的结构和传递条件的试验中发现 把dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫体内 比注入单独的任意一个正义链或反义链的效果均要好 Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物 2000年 Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现 外源性dsRNA通过耗能过程降解成21 23nt的小干扰RNA smallinterferingRNA siRNA 引发RNAi Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA smallhairpinRNA shRNA 表达载体pSUPER 并证实转染该载体可有效 特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达 为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础 Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应 2001年 Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2 5 寡聚腺苷酸合成酶信号转导途径的同时 有效抑制人胚肾293细胞 Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达 RNAi的作用机制 RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行 1 siRNA的形成阶段 2 RNA诱导的沉默复合物 RNA inducedsilencingcomplex RISC 形成阶段 3 效应阶段 4 扩增阶段 RNAi机制 外源 病毒 转座子 目标识别 内切酶切割目标 外切酶降解RNA RdRP合成RNA 激活的siRNA复合物 双链siRNA 异常ssRNA RdRP合成RNA 二级siRNA 目前 RNAi的作用机制主要是在线虫 果蝇和拟南芥等生物体内阐明的 生物体由于RNA病毒入侵 转座子转录 基因组中反向重复序列 invertedrepeats 转录及外源基因导入等原因 细胞中可出现dsRNA分子 当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时 细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA 此阶段需要Rde 1 Rde 4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与 Rde 1 4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合 然后Dicer将dsRNA解旋 再将其裂解为21 25nt大小的小干扰RNA smallinterferingRNA siRNA 1 siRNA的形成阶段 核酸内切酶 核酸外切酶 解旋酶 Dicer 同源搜索活性 siRNAs longdsRNA DicercontainstwoRNAseIIIdomains Dicer定位于胞浆中 但核内mRNA剪切修饰后 向核外运输过程中也存在RNAi现象 可能有其他类似功能的酶发挥作用 现认为21 25nt大小在3 端带有2 3个碱基悬端和5 端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强 siRNAshaveadefinedstructure siRNA具有低分子质量 低浓度 沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点 而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶 PKR 的激活而使其被降解 从而大大减少了其对mRNA的抑制作用 在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNase 核糖核酸酶家族中的第三个家族 该家族的RNase含有两个催化结构域 一个螺旋酶及PAZ模体 motif 其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA 因此 Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键 然而 令人费解的是 为什么Dicer酶的降解产物是21nt 23nt的siRNA呢 最近对RNase 催化结构域的结构的研究使其真相大白 Dicer一种核酸酶 负责将dsRNA转化为siRNA 它属于RNase 家族 具有两个催化结构域 一个解旋酶 helicase 结构域和一个PAZ Piwi Argonaute Zwille 结构域 Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现 其催化结构域在dsRNA上反平行排列 形成四个活性位点 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性 这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA 各种生物体内Dicer结构略有不同 致使siRNA长度存在微小差别 Dicer ModelsforDicercleavage 启始阶段 加工酶 加工成21 23核苷酸片段 DicerRISC mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解 siRNA的形成 siRNA Dicer RISC 2 RNA诱导的沉默复合物形成阶段 生成的siRNA和RNAi特异性酶 如AGO 2 MUT 7 RED 1 PAZ蛋白和DNA RNA螺旋酶结合形成RISC RNA inducedsilencingcomplex 具有序列特异性核酸内 外切酶和解旋酶活性 能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA RNA诱导的沉默复合物 RNA inducedsilencingcomplex RISC 3 效应阶段 siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合 在ATP及解旋酶 如Rde 3 MUT 6 MUT 14 的作用下使siRNA链解离 并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式 同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换 核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5 起始端下游7 10个核苷酸处切断mRNA 起到特异地抑制基因表达的效果 效应阶段 mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解 解旋酶 核酸外切酶 同源性检索活性 核酸内切酶 RISC 在这些机制中 RISC是一个很灵活的平台 在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能 RISC复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小RNA 并用该小RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生 RISCRNA inducedSilencingComplex 解旋酶 核酸内切酶 Argonauteprotein siRNA mRNA 250KD inactive 100KD active ATP 3 25 2020 4 扩增阶段 该反应以siRNA中的一条链为引物 以靶mRNA为模板 在RNA依赖的RNA聚合酶 RNA dependentRNApolymerase RdRP 作用下 扩增靶mRNA 产生新的二级siRNA 而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数 而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA RdRP还是一个重要的 感应器 它能识别正常和异常的RNA 转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程 RNAi扩大效应 目前 对这些现象的解释至少有四种机制 Dicer酶将长dsRNA分子切成短的 初级siRNA 再由后者降解同源的mRNA 故dsRNA的长度决定了放大效应的水平 siRNA在酶作用中 可多次利用 能进一步提供放大的信号 移行RNAi transitiveRNAi 中 siRNA可作为靶mRNA的引物 在RdRP和Dicer等的作用下产生 次级siRNA 导致沉默信号的扩增 异常RNA aberrantRNA 无需引物 可在RdRP的作用下生成dsRNA 并由Dicer酶切生成siRNA 以上四种机制中 尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索 移行RNAi 移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动 即沉默信号沿特定的mRNA由3 5 方向移动 这就是 移行RNAi 在移行RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA 而是在细胞中RdRP的作用下 以初级siRNA的反义链为引物 以靶mRNA为模板 生成dsRNA 随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA 称为次级siRNA 除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外 其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA参与沉默信号的扩增 此外 RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制 1 Dicer将长dsRNA切成初级siRNA 这一放大水平取决于dsRNA的长度 2 siRNA在酶的作用下可以多次应用 产生进一步的放大效应 应用 RNAi主要通过在转录后 post transcriptional 水平阻断基因的表达 导致蛋白无法合成 出现 基因沉默 比如 我们可以按拟定的方式来关闭 shuttingoff 非必需或致病基因的功能 从理论上说 若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈 动物实验已证明 可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因 沉默 病毒性疾病 眼疾 心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中 这一方法为病毒性肝炎 艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路 药物开发 RNAi的应用领域 病毒性疾病的治疗 基因功能研究 肿瘤治疗 1 基因功能研究由于RNAi技术可以利用siRNA使目的基因沉默 研究基因的功能 同时siRNA表达文库构建方法的建立 使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能 对阐明信号转导通路 发现新的药物作用靶点有重要意义 2 病毒性疾病的治疗RNAi机制作为真核生物基因组免疫系统 抑制外源和内源有害基因表达 利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖 利用RNAi技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞 这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA 激发RNAi抑制了HIV 1的coreceptor 辅助受体 CCR5进入人体外周 淋巴细胞 不影响另一种HIV 1的coreceptor CCR4 从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答 由此治疗HIV 1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加 Randall等证明了针对HCV 丙型肝炎病毒 RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍 将siRNA转染至已有HCV感染 复制的细胞 siRNA对98 以上可检测到HCV抗原 HCV复制活跃的细胞有抑制作用 siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性 Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制 阻止相关蛋白表达的作用 Fig3 RNAi的抗病毒机制 3 肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因 癌相关基因或突变基因的过度表达 使这类基因保持在静默或休眠状态 从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤 1 RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因 2 RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达 3 RNAi可应用于抑制基因扩增 4 药物开发 利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处 因为基因组研究成果和高通量的筛选技术 为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础 在药物开发过