犬繁殖育种技术最新研究进展-学术报告.pptVIP

2020 3 25 犬的繁殖育种技术最新研究进展 2013 07 16 南京农业大学李群黄勇 犬是人类最早驯化的动物之一 驯化时间大约在1 4万年以前 今天 犬仍以其非凡的功能 在军事 警务 护卫 牧畜 狩猎 导盲 伴侣等方面发挥着卓越的作用 史宾格犬 拉布拉多犬 比利时马里努阿犬 比格犬 犬的繁育是一项很复杂的过程 包括大量选育亲本犬 强化或弱化某些特征 或者使其发生形态 生理和行为的变化 许多经过长期选育的犬 出于配对选择的目的 已经具有了各种不同的体型 大小 颜色和行为特征 现今世界上可以确认并正在被人类使用的犬品种大约有400个 传统繁育技术 犬的传统选配方法主要是同质选配和异质选配 其繁育则分为纯种繁育和杂交繁育 纯种繁育是以同一品系的犬进行交配以达到品种的保纯 杂交繁育是利用不同品系犬之间的互相交配而改良后代的繁殖方法 杂交繁育的主要目的就是获得杂种优势 改善现有品种犬的特征以及培育出新品种犬 纯种繁育 杂交繁育 犬的繁殖技术 犬的繁殖技术的研究起始于18世纪 1780年意大利生物学家Spallanzani首次进行犬人工授精 AI 试验取得了成功 这开创了动物繁殖技术研究的先河 斯帕兰札尼 Spallanzani Lazzaro 但目前犬繁殖调控技术的研究远远落后于其他哺乳动物 这是因为犬的生殖生理具有独特性 对其还缺乏准确了解 从而使得犬繁殖调控技术面临着一些困难 尤其是卵子和胚胎在体外培养及发育的效率很低 犬繁殖调控技术的研究还很落后 现代繁育技术 犬的现代繁殖技术往往和育种技术相结合 其目标也是选育出满足人们需要的犬种 或者是加强和改良现有犬种的品质特征为目的 犬的现代繁殖育种技术可分为 1 犬的发情调控技术 2 人工授精技术 3 胚胎体外培养和移植技术 4 体外受精技术 5 克隆技术 6 转基因动物育种技术等 一 犬的发情调控技术 母犬达到性成熟和配种季节到来后仍未发情 可采用激素诱导发情 目前国内外诱导母犬发情的外源性激素和方法大致包括 合成雌激素 己烯雌酚 多巴胺受体激动剂 促性腺激素释放素 GnRH 外源性促性腺激素 LH FSH HCG PMSG 促乳素抑制因子PIF 前列腺素PGF2 等 国外利用激素调控母犬发情很早 从1939年以来 已经有超过40种的激素类处理组方用于诱导犬的发情 国内扬州大学的余道伦等研究 用大剂量的 500IU 孕马血清促性腺激素 PMSG 可以有效地诱导母犬发情排卵 但受孕率较低 2008年 黑龙江尚志市畜牧发展中心王禄华等人应用PGF2 结合PMSG对母犬进行诱导注射 均使犬出现了发情症状 发情率为100 但受配率也较低 在生产中 育种工作者常采用人绒毛膜促性腺激素hCG与PMSG结合使用的方法诱导发情期母犬发情 PGF2 hCG与PMSG联合使用具有促进母犬发情 卵泡发育和超数排卵的功能 并能维持早起胚胎的着床 笔者曾试过 孕妈血清促性腺激素 PMSG 和人绒毛膜促性腺激素 HCG 以及促黄体生成素 LH 有一定效果 但受孕率不高以及后遗症问题值得考虑 犬的人工授精是将人工采集的公犬精液输入母犬生殖器官内 使精卵结合 从而达到繁殖后代的方法 犬是最早成功实现人工授精的哺乳动物 早在1780年 意大利人Spallanzani就已经掌握了这项技术 20世纪60年代低温储藏精液和冷冻精液技术的发展成熟 使欧美国家犬的繁殖育种业得到巨大发展 二 人工授精 AI 技术 便捷型犬输精枪 在国外 犬人工授精技术甚至被认为是繁殖幼犬的首选方式 因为采用这项技术具有许多优点 而且 人工授精技术可以使某些自然交配困难或者交配难度大的公母犬 如公母犬体型差距过大 公犬过于凶猛 以及名贵母犬等 达到顺利繁殖后代的目的 因此在国外 绝大多数血统纯正的犬都是通过人工授精技术繁殖后代的 2004年 瑞典乌普萨拉农业科学大学的Ponglowhapan等研究了犬冷冻精液在长期存储过程中葡萄糖和果糖对精液品质的影响 研究表明 在卵黄一Tris稀释液中 70mmol L的果糖对精子的冷冻储藏效果最好 但是犬冷冻精液在相同的条件下优先消耗的能量物质却为葡萄糖 目前我国犬的人工授精推广还很不够 还没有形成统一的犬精液冷冻和人工授精操作标准 这就需要我们犬业繁殖工作者不断借鉴国外已有的成功经验 从而制定切实可行的操作程序 使之尽早服务于我国的犬业生产 目前我国生猪普遍推行人工授精技术 猪的人工授精在世界各地已经得到了广泛使用 目前 世界上每年大约有2500万头次猪进行人工授精 其中 超过99 的人工授精使用的是储存在15 20 下 最多保存3天的液态冷藏精液 蓝狐的人工授精技术在蓝狐养殖业中得到了很好的推广 人工授精技术可以提高优良种公狐的配种能力 公狐自然交配时最多交配3 5头 采用人工授精技术 1头公狐的精液可以输入给50 100头母狐 而且受精率得到了很大的提高 人工授精技术抓住授精期和授精技术这两个环节是提高蓝狐繁殖的有利保证 三 犬的胚胎体外培养 IVP 和移植 ET 技术 动物胚胎移植技术已有100多年的研究历史 1890年Heape在英国剑桥大学报道的兔子胚胎移植是最早的胚胎移植实验 随后世界各国相继报道了山羊 绵羊 小白鼠 猪 牛 马等动物胚胎移植的成功 胚胎移植技术是采用 超排 技术从母畜体内获得大量卵子 在体内或体外受精而得到大量胚胎 这样不仅使优良母畜的遗传资源得到开发 提高其繁殖力 而且更能加速动物品种的改良 曾红极一时的波尔山羊胚胎移植 目前 有关于犬胚胎移植的研究 国内外的报道并不多见 Kinney等人1977年最先报道了犬受精卵的移植成功 日本的武石等人1988年首次用人工诱导发情的方法对犬移植受精卵并繁育出了仔犬 2001年黄家良报道胚胎移植在诱导发情9日排卵后的母犬身上获得成功 Acchdald报道用促性腺激素引起母犬发情和排卵后 利用收集的胚胎 经PMSG和HCG处理的母犬受孕率高 日本兽医生命科学大学的TsutsuiT等人认为犬的胚胎移植之所以成功率较低 主要是因为受其超数排卵和同期发情的限制 2001年他们比较了采用子宫切除术和子宫冲洗术分别收集到的犬胚胎回收率 研究表明 前一种方法的回收率显著高于后一种方法 分别为97 1 和42 5 胚胎移植技术主要包括供体犬超排处理 受体犬同期发情 供体母犬配种 输精 胚胎收集 采卵 和胚胎保存和移植五个步骤 此外胚胎移植技术还包括胚胎冷冻 胚胎分割 胚胎融合 卵核移植 性别鉴定 体外受精及基因导入等技术 2006年日本大阪府立大学生命与环境科学学院的HatoyaS SugiyamaY等人研究认为 犬胚胎在排卵后9d发育到桑椹胚 大约在同一时间到达子宫角 胚胎在排卵后12d发育到扩展囊胚 但是这一时期的胚胎不适合移植 因为在操作的时候胚胎容易发生收缩 因此 一般选择排卵后9d 11d的胚胎移植到子宫角 体外受精 IVF 技术 体外受精也称为试管受精 方法是将成熟卵子和精子通过一系列的生物学手段在试管中完成受精的技术 目前 体外受精的方法有透明带开孔法 卵黄间隙精子注入法及卵细胞质精子注入法3种 四 体外受精 IVF 技术 体外受精 2006年 智利天主教大学生物科学学院的DelosReyes等人进行了犬体外受精实验 结果表明 精子穿入未成熟卵母细胞时非常容易发生多精受精 多精受精的比例能达到59 犬的体外受精 基于上述困难 目前犬的体外受精研究仍在探索中 犬克隆是由英文单词clone音译而来 是无性繁殖的意思 动物克隆技术是指把动物体的细胞核移植入去核的动物卵母细胞中 构建新的重组胚胎 并使重组胚胎发育为同提供细胞核的供体动物基因型相同的后代 克隆技术能使动物无需经过有性繁殖 直接产生动物后代的生物技术 五 克隆技术 1997年世界首例体细胞克隆绵羊Dolly的诞生 使人类认识到高度分化的成年动物体细胞核在体外通过核移植技术具备完全发育成单独个体的全部能力 即体细胞全能性 自Dolly诞生以来 人们相继在羊 牛 猪 小鼠 兔 马等动物上获得了克隆后代 1997年克隆羊 多莉 2005年 韩国首尔大学的黄禹锡和他的科研小组成功培育出世界首条品种为阿富汗猎犬的克隆犬 斯纳皮 2006年 世界首例体细胞克隆犬获得成功 此次GJang等人是将重组胚胎经融合激活后不经体外发育直接移植入受体母犬子宫内妊娠 并成功了产出了与供体细胞核基因型一致的个体 2005年 世界第一只克隆犬阿富汗猎犬 斯纳皮 现阶段 犬种动物的体细胞克隆效率低 成功难度大 主要受到下面几方面的影响 体外获得成熟犬卵母细胞难度很大 犬的卵母细胞体外成熟培养率很低 这是因为犬的排卵发生在第一次减数分裂开始时 卵子要在输卵管经发育才至成熟 此外 犬的诱导发情技术还不完善 获得同期发情的供受体难度较大 体外胚胎培养体系不完善 重组胚胎很难进行体外发育 犬卵母细胞体外成熟效率比其他哺乳动物和实验动物低 南农大成功克隆4只转基因奶山羊 2011年4月8日 13日 14日凌晨 位于山东曹县的南京农业大学克隆羊基地传来喜讯4只带有人乳铁蛋白基因的克隆羊先后顺利降生 目前这4个小家伙各项体征正常 这标志着南农大动物胚胎工程技术团队承担的国家 高产优质转基因奶羊新品种培育 项目子任务 历时两年终获成功 这是我国生物新品种培育重大专项研究的一个重要突破 4个小家伙的 亲本 是西北农大的一头萨能奶山羊 去年他们从这头纯种母羊耳朵上取了指甲盖大小的一块皮肤组织 从这小块组织中提取的耳皮肤成纤维细胞 就是克隆羊的基因来源 即供体细胞 通过对供体细胞处理 培育出转基因克隆胚胎 最后借用 代孕母羊 生出后代 因此 代孕母羊虽然经过5个月怀胎 最终生产出克隆小羊 但它们之间并不存在遗传关系 小羊们反而都跟 亲本 一样 长着一对高高上翘的大耳朵 江苏省农科院成功克隆6只转基因奶山羊2011年12年14日 从省农科院畜牧研究所获悉 该所动物遗传资源与草食家畜育种项目组成功克隆出6只转基因奶山羊 如图资料图片 其中两只携带人乳白蛋白基因 据介绍 这6只克隆奶山羊的诞生经历了基因克隆 载体构建 细胞转染 体细胞核移植及胚胎移植等一系列复杂程序 目前生长状况良好 现在又有几十只母羊怀孕了 待5个月孕期满后 明年春天 将诞生第二批克隆奶山羊 不过 这几十只怀孕母羊生出的小羊不一定都是能成功表现克隆基因的克隆羊 要检测才能确定 即使是克隆羊 也不一定都能成功表现出人乳白蛋白基因 南京农业大学徒手技术克隆猪获得成功 2012年9月15日 一胎8头体细胞克隆小猪诞生 这是南京农业大学首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪 这标志着该校利用徒手克隆技术生产克隆猪取得重大突破 徒手克隆技术指利用一般的显微镜 手工把卵切成两半 去核 然后再将不带核的卵重新组合 徒手克隆技术简便易学 成本低 效率高 无需昂贵仪器设备 正逐渐成为生产转基因克隆猪 牛 羊等动物的主流技术 转基因动物育种技术 20世纪80年代以来发展的转基因动物技术是指将已知的外源基因导入动物细胞并稳定整合到动物细胞基因组中 使外源基因表达的技术 1980年转基因技术首先在小鼠上获得成功 六 转基因动物育种技术 1982年 美国科学家Palmiter等将大鼠生长激素 GH 基因导入小鼠受精卵中获得转基因 超级鼠 被认为是世界上首批转基因动物 1990年 美国GenzymeTransgene公司通过原核显微注射法获得了世界上第1头转基因牛 1997年 乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功 2005年抗乳房炎转基因牛的诞生 2006年多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功 2009年4月 英国 新科学家杂志 报道了韩国首尔国立大学李炳春 Byeong ChunLee 研究小组通过成纤维细胞克隆技术成功培育出5只砖红色荧光基因比格犬 这是世界上第一批转基因实验犬 5只比格犬在紫外光线下都呈现出红色荧光 10天大的克隆基因犬皮下可见红色蛋白 10天大的克隆基因犬在紫外线下发红色荧光 左右两头犬有红色荧光基因 中间这只犬狗没有这一基因 转基因动物育种技术方法 一 逆转录病毒载体法 逆转录病毒法 就是将外源基因替换病毒基因组的反式元件 通过顺式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体 然后注射到MII期的卵母细胞 体外受精和筛选 即将目的基因重组到逆转录病毒载体上 然后人为感染着床前或着床后的胚胎 也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的 通过病毒将外源目的基因整合到宿主基因组DNA中去 逆转录病毒法是最早用于生产转基因动物的方法 但是由于细胞转染过程中不能准确控制外源基因的整合时间 得到的转基因动物大都为嵌合体 所以此项技术并未获得更为深入的发展 二 显微注射法 通过显微操作仪把获得的外源基因片段注入到动物受精卵中 随后 外源基因片段随机整合到动物受精卵染色体上 通过受精卵的发育获得转基因动物 1982年 Palmiter等首次利用显微注射方法将大鼠表达生长激素基因片段导入到小鼠受精卵中 获得了转基因 超级鼠 现今 显微注射法被广泛用于转基因动物领域的研究 并成功生产了转基因兔 绵羊 猪 牛 鱼和鸡等动物 三 精子介导载体法 大多数物种的精子都有一定的摄取外源DNA的能力 并可以通过受精过程把外源基因整合到受精卵染色体当中 此方法获得的转基因动物效率高达30 左右 1989年 意大利Lavitrano等通过精子介导法成功获得具有转氯霉素乙酰转移酶基因 CAT 的转基因小鼠 四 慢病毒载体技术 携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒 细胞系的辅助下 经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒 通过感染细胞或活体组织 实现外源基因在细胞或活体组织中表达 慢病毒载体技术是一种高效制备转基因动物的技术 细胞转染效率高达60 以上 比如 通过此项技术生产1只转基因绵羊只需5只受体母羊 而采用传统的转基因技术则需要70只受体母羊 基因靶技术是一种定向的转基因技术 其主要是指定向的将动物基因组当中不需要或不利基因座基因敲除 以及将目的基因整合到基因组特定位点的基因敲入技术 2000年 McGreath等首次应用基因靶技术 将羊的某段基因用人类基因替换 并成功生产了转基因克隆羊 结语和展望 现今 犬繁殖调控技术的发展仍比较缓慢 主要是由于犬科动物的生殖生理和其他动物具有较大差异 目前人们对犬的特殊生殖生理 输卵管环境等的研究相对比较匮乏 使得可用于其它物种的体外培养系统不能适用于犬科动物 未来 人们可利用转基因技术培育出具有特殊作用的犬种 比如 培育出嗅觉特别灵敏的超级作业犬 抵抗狂犬病 犬瘟热 犬细小病毒等病毒感染的转基因犬 培育体大如牛的巨型犬 迷