苦瓜抗白粉病SRAP标记筛选的PCR体系优化与验证.pdf

南方农业学报J O U R N A L0 Fs 0 U T H E R NA G R I c U L T U R E2 叭3 4 4 6 8 9 8 9 0 2 I S S N2 0 9 5 一l1 9 l C O D E NN N X A A Bh t t P w w n f n y x b c n D O I 1 0 3 9 6 9 j is s n 2 0 9 5 1 1 9 1 2 0 1 3 6 8 9 8 苦瓜抗白粉病S R A P 标记筛选的 P CR 体系优化与验证 米军红t 一 尚小红z 3 a 周生茂z 3 a 车江旅3 黄如葵2 3 梁任繁2 3 a 文俊丽2 n 郭元元2 3 a 梁和1 1 广西大学农学院 南宁5 3 0 0 0 5 2 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 南宁5 3 0 0 0 7 3 广西农业科学院8 蔬菜研究所 南宁5 3 0 0 0 7 摘要 目的 优化苦瓜抗白粉病s R A P 标记的P c R 体系 为获得苦瓜抗白粉病的s R A P 分子标记 加快苦瓜抗白 粉病新品种的选育提供参考 方法 采用正交设计L 4 5 在已有s 镭 P c R 扩增程序基础上 以苦瓜抗 感白粉病 的父母本及其杂交后代基因组D N A 为模板 用4 对s R A P 引物对模板D N A d N T P s M 矿 引物 A qD N A 聚合酶等5 个 因素浓度进行优化组合和验证 结果 提取的苦瓜基因组D N A 纯度较好 无蛋白质 R N A 等物质污染 其纯度和完 整性较好 利用引物对M E 9 E M l1 进行P C R 扩增 1 6 个不同因素组合处理在苦瓜父本M c l 8 和母本M C l 一2 的基因组 D N A 间的扩增结果有明显差异 其中以处理3 的s R A P P c R 体系 2 0 o 斗L D N A5 on 斗L d N T Po 0 5m m o l L M 妒 2 5m m o l L 引物0 6 恤m o 儿 丁a qD N A 聚合酶0 0 8 8u 斗L 获得较清晰 较多的扩增条带 用4 对引物对验证优化的 s R A P P c R 体系 其重复性好 不同苦瓜材料问无明显的多态性 结论 优化的s R A P P c R 体系适用于苦瓜抗白粉病 s R A P 分子标记的筛选 关键词 苦瓜 s R A P P c R 体系优化 筛选 验证 中图分类号 s 6 4 2 5文献标志码 A 文章编号 2 0 9 5 一1 1 9 1 2 0 1 3 0 6 0 8 9 8 0 5 O p t im iz in ga n d V e r if ic a t io no fP C R s y s t e mf o rS R A P m a r k e r s c r e e n in gr e l a t e dt op o w d e r yd is e a s er e s is t a n c einb it t e rm e l o n M o n l o r d 蛔曲a r a n t j a M IJ u n h o n g1 一 S H A N GX ia o h o n 9 2 3 a Z H O U S h e n g m a 0 2 3 C H EJ ia n g l n 3 H U A N GR u k u i2 3 r L I A N GR e n f a n 2 3 a W E NJ u n l i2 G U OY u a n y u a n 2 L I A N GH e l 1 A 酾c u l t u r a lC o l l e g e G u a n g x iU n iv e r s it y N a n n in g5 3 0 0 0 5 C h in a 2 G u a n g x iC r o p sG e n e t ica n dI m p r o v e m e n t B io t e c h n 0 1 0 9 yL a b N a n n in g5 3 0 0 0 7 C h in a 3 3 V e g e t a b l eR e s e a r c hI n s t it u t e G u a n 函A c a d e m y o f A 刚c u l t u r a lS c ie n c e s N a n n in g5 3 0 0 0 7 C h in a A b s t r a c t 0 b ie c t iv e T h ep r e s e n ts t u d vw a sc o n d u c t e dt oo p t im iz et h eP C Rs y s t e mo fS R A P m o l e c u l a rm a r k e rr e l a t e dt o D o w d e r vd is e a s er e s is t a n c einb it t e rm e l o nf o rp r o v id in gr e f e r e n c eo nb r e e d in gn e wb it t e rm e l o nc u l t iv a r sr e s is t a n tt op o w d e r y d is e a se M e t h o d 0 nt h eb a s iso f t h ek n o w nS R A P P C Ra m p l if ic a t io np r o c e d u r e t h ec o n c e n t r a t io nc o m b in a t io n so f D N At e H 卜 p l a t e d N I P s M 9 2 p r im e r T a qD N Ap o l y m e r a s ew e r eo p t im iz e da n dv e 6 e db yo r t h o g o n a ld e s ig nL 1 6 4 5 w it ht h eg e n o m e D N Ao fp o w d e r yd is e a s e r e s is t a n ta n d s u s c e p t ib l ep a r e n t su s e da st e m p l a t e sa n df o u rp a irp r im e r s R e s u l t T h ee x t r a t e db it t e r m e l o ng e n o m icD N As h o w e db e t t e rp u r it va n din t e 鲥t y a n dh a dn op o U u t io nf o rp r o t e ina n dR N A e t c T h ep r im e rp a irM E 9 E M l1w a su s e df o rP C Ra m p l i矗c a t io na n dg o to b v io u sd if k r e n c ein1 6P C Rs y s t e m so fg e n o m icD N Ainp a r e n t sM C l 8a n d M C l 2 A m o n g1 6P C Rs v s t e m s t h e3 山s v s t e mw a st h eo p t im u ms y s t e mo fS R A P P C R f o rg e t t in gc l e a ra n dm o r ea m p l m e d b a n d s w h ic hc o n t a in e dD N A5n 蜀仙L d N T P s0 0 5m m o l L M 矿2 5m m o 儿 p r im e r0 6 恤m o l L T a qD N Ap o l y m e r a s e0 0 8 8 U 仙L int o t a l2 0 LF o u rp r im e rp a ir sw e r eu s e dt ov e r if yt h eo p t im iz e dS R A f L P C Rs y s t e mf o rd if f e r e n tb it t e rm e l o nm a t e r ia l s I ts h o w e dg o o dr e p e t it io na n dn op o l y m o r p h is m C o n c l u s io n T h eo p t im iz e dS R A P P C Rs y s t e mw a ss u it a b l ef o rs c r e e n in g S R A Pm a r k e rr e l a t e dt op o w d e r yd is e a s er e s is t a n c einb it t e rm e l o n K e yw o r c b b it t e rm e l o n S R A P P C R s y s t e mo p m iz a t io n o r t h o g o n a ld e s ig n s c r e e n in g v e r if ic a t io n 收稿日期 2 0 1 3 0 3 2 6 基金项目 国家自然科学基金项目 3 1 2 4 0 0 6 0 广西科学研究与技术开发计划项目 桂科攻1 0 1 0 0 0 0 5 6 广西自然科学基金项目 2 0 1 2 G x N s F A A 0 5 3 0 6 1 广西农业科学院基本科研业务专项项目 桂农科2 0 1 2 Y 咖5 广西农业科学院公益性维持费 项目 桂农科2 0 1 2 G w 0 4 作者简介 为通讯作者 周生茂 1 9 7 0 一 博士 副研究员 主要从事蔬菜育种与分子生物学研究工作 E m a il m a o m a o z h o u 7 0 鼯a a s n e t 黄如葵 1 9 6 9 一 博士 研究员 主要从事蔬菜育种与分子生物学研究工作 E m a il r k h u a n g g a a s n e t 米军 红 1 9 8 7 一 研究方向为蔬菜育种与分子生物学 E m a il 3 8 0 6 5 9 0 1 6 q q c o m 米军红等 苦瓜抗白粉病S R A P 标记筛选的P c R 体系优化与验证 8 9 9 0 引言 研究意义 瓜类作物属于葫芦科植物 全世界有 1 2 0 个属和1 0 0 0 个种 主要分布在热带和亚热带地区 F A O 2 0 0 8 其中苦瓜 黄瓜 冬瓜 丝瓜 南瓜和西 瓜是我国主要瓜类蔬菜 在我国蔬菜生产中占有极其 重要的地位 谢大森等 2 0 1 0 近年来 白粉病 霜霉 病等真菌性病害在瓜类蔬菜上普遍发生 严重制约了 我国蔬菜产业的发展 王文桥等 2 0 1 0 过去尽管传 统育种技术曾在瓜类蔬菜抗逆育种中发挥了重要作 用 但是传统育种速度已不能满足瓜类蔬菜生产中品 种更新换代的需求 因此 非常有必要开发新型瓜类 蔬菜育种方法 以加快瓜类蔬菜抗病育种进程 近年 来 随着D N A 分子标记辅助育种技术在许多植物研究 上的成功开发和应用 岳思君等 2 0 0 5 D N A 分子标 记技术对加快瓜类蔬菜抗病育种具有重要意义 前 人研究进展 近年来 R F L P R A P D I S s R s s R A F L P S C A R C A P S S N P E S T S R A P 和T R A P 等十几种D N A 分子标记技术被相继开发 并成功应用于植物遗传多 样性分析 辅助育种 差异基因筛选 基因定位和比较 基因组学等方面的研究 王芙蓉等 2 0 0 2 柳李旺等 2 0 0 4 在这些D N A 分子标记技术中 L i和Q u ir o s 2 0 0 1 开发的D N A 序列相关扩增多态性 s e q u e n c e r e 1 a t e da m p l if ie dp o l y m o r p h is m s A J P 具有操作简便 中等产量 高共显性 重复性好 易于分离条带及测序 等优点 李巧燕等 2 0 0 6 已在苦瓜 郭大龙等 2 0 0 8 黄瓜 柴丹丹等 2 0 0 8 南瓜 刘泽发等 2 0 0 8 西瓜 李晓慧等 2 0 0 7 江海坤等 2 0 1 1 丝瓜 李莲芳等 2 0 1 1 等瓜类蔬菜的研究中成功应用 赵光伟等 2 0 1 0 以感白粉病甜瓜A 1 2 0 和抗白粉病甜瓜A 1 1 9 为 亲本构建F 2 f 弋分离群体 采用B s A 和s R A P 相结合的方 法筛选与甜瓜抗白粉病基因相连锁的分子标记 景然 等 2 0 1 1 以高抗和高感白粉病的黄瓜亲本及其杂交 后代F 2 分离群体为材料 应用s 黜廿技术开展与黄瓜白 粉病抗性基因连锁的S 黜廿分子标记研究 张学军等 2 0 1 3 以抗病甜瓜资源为材料 在苗期进行白粉病抗 性鉴定 分析了白粉病抗源收集一号的抗性遗传规 律 并利用集团分离分析法结合S 黜心标记进行连锁 分析 本研究切入点 虽然s 凡垤分子标记技术在部 分主要瓜类蔬菜研究中被广泛应用 但是不同学者研 究获得的S 凡垤 P C R 扩增条件和反应体系不尽一致 可能是因不同品种和地域环境不同所造成 此外 目 前有关苦瓜抗白粉病的S R A P 标记的P C R 体系优化的 研究报道较少 拟解决的关键问题 为了获得苦瓜抗 白粉病的S 鼬廿分子标记 在前人研究基础上 进一步 优化S R A J P P c R 体系 为加快苦瓜抗白粉病育种进程 奠定基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试苦瓜材料由广西农业科学院蔬菜研究所苦 瓜课题组提供 种植于广西农业科学院蔬菜研究所试 验基地 以栽培型高感白粉病苦瓜M C l 2 为母本 野 生型高抗白粉病苦瓜M c18 为父本 杂交后构建F 代 分离群体 种子经催芽后播种于育苗钵中 待幼苗长 至3 片真叶时取样 取叶片后立即放人液氮瓶速冻 然 后贮存于一8 0 备用 单株白粉病鉴定在广西农业科 学院植物保护研究所进行 1 2 试验方法 1 2 1D N A 的提取和检测参照M a g u ir e 等 1 9 9 4 和高志民等 2 0 0 6 的c T A B 法 苦瓜每份材料分别取 约1 og 提取基因组D N A 分别用w D 一9 2 0 3 B 紫外分光 光度计测定0 D 孙O D 瑚和O D 瑚值 同时用琼脂糖凝 胶电泳检测 用T E 缓冲液将D N A 稀释5 0 倍 或1 0 0 倍 用T E 缓冲液作空白调零后 测定O D o D 值是 否在1 6 1 8 O D 0 D 瑚值是否大于2 0 琼脂糖凝胶 电泳时按5 0 0n 斗L 的比例加入d d H 0 配成统一浓度 取4 0 L 在1 0 琼脂糖凝胶上电泳 观察D N A 主带 是否清晰或弥散 以验证有无R N A 污染和D N A 降解 检测后 于一2 0 下保存备用 1 2 2S 心一P C R 反应体系优化设计采用正交设 计L 4 s 对P c R 反应中的5 个因素 n qD N A 聚合酶 M 矿 模板D N A 引物 d N T P 在4 个水平上进行试验 各因素水平见表1 共设计1 6 个处理组合 3 次重复 L 4 5 设计方案见表2 表1 苦瓜s 黜奸 P c R 体系正交设计因素水平 T a b 1L e v e l so ff a c t o r sf o rS R A P P C Rs y s t e minb it t e rm e l o n w it ho r t h o g o n a ld e s ig n 1 2 3S 凡岬一P C R 扩增条件 在B io m e 仃aT P r o f e s s io n a l 型P c R 仪 华粤行仪器有限公司 上进行P c R 扩增 反应程序 9 4 预变性5m in 9 4 1m in 3 5 1m in 7 2 1m in 进行5 个循环 9 4 lm in 5 0 1m in 7 2 1m in 进行4 0 个循环 7 2 1 0m in 4 保存 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成 体系筛 选引物为M E 9 E M l l 表3 n qD N A 聚合酶 M 矿 d N T P s P C R b u 疵r 均购自生工生物工程 上海 股份 有限公司 南方农业学报 1 2 4P c R 产物检测用7 的非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳检测反应产物 取出4 0 恤L 反应产物加人 1 0 斗L 的6 L o a d iI l gB u 腩r 混匀 预电泳3 0m in 取 2 0 斗L 混匀产物点样 当二甲苯氰移至胶板尾端琼 脂糖封底胶上时 停止电泳 银染显影 胶片拍照并记 录分析 表3S 凡心引物序列 T a b 3P r im e rs e q u e n c e su s e df o rS R A P P C Rinm es t u d y 1 2 5 验证优化的反应体系在验证优化的S R A J P P c R 体系中 以苦瓜父本M c l 8 基因组D N A F 代分离 群体中抗 感单株基因组D N A 混合池为模板 以反应 引物对m 9 E M l l M E 3 E M 3 M E l l E M l l 1 8 E M l 8 进行验证 表3 每对引物重复3 次 以2 琼脂糖 凝胶电泳检测 2 结果与分析 2 1苦瓜基因组D N A 的提取和检测 利用c T A B 法提取苦瓜父母本及F 代分离群体中 抗 感白粉病单株基因组D N A 结果显示 表4 O D O D 2 鲥值为1 5 7 9 1 9 6 5 基本在1 1 8 0 D O D 2 3 0 值大 于2 0 说明所提取的基因组D N A 纯度较好 无蛋白 质 R N A 等物质污染 残存的盐离子和小分子杂质较 少 根据D N A 浓度测定结果 大部分植株的基因组 D N A 浓度在1 5 0 0n 斗L 左右 说明所提取的基因组 D N A 浓度较高 用1 琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 苦瓜基因组D N A 图1 结果显示 苦瓜父母本D N A 和 抗 感白粉病单株的D N A 混合池主带清晰 无弥散 超 过2 0 0 0 0b p 证明无R N A 污染和D N A 降解 综合分析 所提取的苦瓜基因组D N A 纯度和完整性较好 可以用 于后续试验 正向引物F o 刑a r d p r im e r 引物序列 5 一3 P r im e rs e q u e n c e反向引物R e v e r S ep r im e r引物序列 5 一3 P r im e rs e q u e n c e M 哐9T G A G T C C A A A C C G G A G GE M l lG A C T G C G T A C G A A T T C C A M E 3T G A G T C C A A A C C G G A A TE M 3G A C T G C G T A C G A A T T G A C M 哐1 1T G A G T C C A A A C C G G A A C E Ml lG A C T G C G T A C G A A T T C C A N 正1 8T G A G T C C A A A C C G G G C TE Ml8G A C T G C G T A C G A A T T C A C 2 1 2 2 6b D 5 1 4 8b D 图1苦瓜基因组D N A 琼脂糖凝胶电泳结果 F i2 1E l e c 仃o p h o r e s isa I l a l V s e so fg e n o m icD N Ao fb it t e rm e l o nina g a r o s eg e l s M 2 0k b D N A L a d d e r M a r k e r 1 母本M c l 2 2 父本M c l 8 3 F 2 分离 群体感白粉病单株混合基因组D N A 4 F 分离群体抗白粉病单株混 合基因组D N A M 2 0k b D N A L a d d e r M a r k e r 1 2 3 4r e p r e s e n t e d m a t e m it y M C l 一2 p a t e m 时M C l 8 m ix e dD N A 台D me a c hp o w d e r yd is e a s e s u s c e p t ib l e p l a n t sinF 2s e g r e g a t io np o p u l a t io na I l dm ix e dD N A 如m e a c hp o w d e r y d is e a s e r e s is t a n tp l a n t sinF 2s e g r e g a t io np o p u l a t io n r e s p e c t iV e l y 2 2S 廿一P C R 体系的优化 根据正交设计L 4 5 对n qD N A 聚合酶 M 矿 模板D N A 引物 d N T P 等5 个因素在s R A P P C R 体系中 的浓度进行组合优化 分别以苦瓜父本M c l8 和母本 M C l 2 的基因组D N A 为模板 在相同条件下利用引物 对M E 9 一E M l l 进行P c R 扩增 图2 结果显示 不同因素 组合体系扩增结果有明显差异 体系1 6 11 1 2 1 4 1 5 1 6 没有条带 无扩增产物 体系2 5 7 9 1 0 1 3 有 部分条带 说明扩增产物少 体系3 4 8 条带最多 最 清晰 但体系8 的泳道背景色较深 综合比较3 4 两个 反应体系中各因子的浓度 体系3 较体系4 的各因素浓 度低 且得到较清晰 较多的扩增条带 因此 在不影 响结果的条件下 体系3 更经济 初步确定在正交设计 的1 6 个组合体系中 以反应体系3 较优 2 3 S R A P P C R 优化体系验证 根据优化获得的S 融廿 P C R 体系 以苦瓜父本 M c l 8 及F 2 代分离群体中抗 感白粉病单株基因组 D N A 混合池为模板 以M E 9 E M 1 1 M E 3 E M 3 M E l1 E M l l M E l 8 E M l 8 为反应引物对 进一步验证上述 所筛选的s 凡垤 P c R 体系 图3 结果显示 在所有模板 中 每个反应重复3 次的结果基本一致 除引物对 M E l 8 E M l 8 未能获得明显条带外 其他反应均有明显 的条带 尤其是引物对M E 9 E M l1 在3 份苦瓜材料基 因组D N A 中均获得最多条带 但在3 份苦瓜材料基因 一 一 一一一一一一一一 一一 一一一 一一 一一一一嘴一一M加撕如加 如 如 加如撕加 一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 米军红等 苦瓜抗白粉病s R A P 标记筛选的P c R 体系优化与验证 9 0 1 组中 琼脂糖凝胶电泳结果没有明显差异 说明优化 的反应体系能够满足苦瓜基因组D N A 的S 黜廿扩增要 求 可用于苦瓜分子标记筛选及遗传学研究 2 0 0 0 l 0 0 0 7 5 0 5 0 0 2 5 0 1 0 0 2 0 0 0 l 0 0 0 7 5 0 5 0 0 2 5 0 M12 3 456 7 8 91 01 1 1 21 31 41 51 6 A B 图2s R A P P C R 不同体系扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 F ig 2E l e c t r o p h o r e s isa n a l y s e so f p r o d u c t s 锄p l if ie db yS R A P P C Ri p o l y a c r y l a m id eg e l s A 苦瓜父本M c l 8 B 母本M C l 一2 M 2k bD N AL a d d e rM a r k e r 1 1 6 正交设计1 6 个反应组合 A p a t e m it yM C l 8o f b in e rm e l o n B m a t e m it yM C l 2o f b in e rm e l o n M 2 k bD N AL a d d e rM a r k e r 1 1 6 1 6c o m b in a t io n so f O r t h o g o n a l d e s ig n r e s p e c t iv e l y 0 0 0b p 9 2 8 器 5 0 0b p 2 5 0b p 1 0 0b p 表4 苦瓜基因组D N A 检测结果 T a b 4D e t e m l il l e dr e s u h so fg e n o m icD N A inb i讹rg o l l r d 编号O D 2 6 00 D O D 2 3 0O D 0 D m0 D O D 浓度 n 灿 N o C o n c e n 仃a t io n 10 6 6 5O 3 6 00 3 1 71 8 4 7 2 0 9 81 3 3 0 20 7 0 6O 4 1 60 3 4 8 1 6 9 72 0 2 91 7 6 5 31 2 5 0 O 6 8 50 5 9 91 8 2 42 0 8 7 3 1 2 5 41 0 2 7O 5 7 70 4 6 21 7 8 l2 2 2 3 2 5 6 7 51 4 9 6O 7 9 80 6 9 51 8 7 5 2 1 5 32 9 9 2 60 3 0 3O 1 9 l0 1 3 l 1 5 8 32 3 1 37 5 7 70 2 8 4O 1 5 90 1 4 0 1 7 8 72 0 2 97 1 0 80 2 3 9O 1 2 70 0 9 91 8 8 l2 1 4 l 5 9 7 9O 3 0 4O 1 7 0 O 1 5 01 7 8 92 0 2 76 0 8 1 0O 3 1 60 1 7 80 1 3 71 7 8 02 3 0 76 3 2 1 1 O 2 9 8 0 1 6 8O 1 4 81 7 7 22 0 1 45 9 6 1 2O 4 7 60 2 5 9O 1 9 71 8 3 82 4 1 611 9 0 1 30 1 5 60 0 9 1O 0 7 5 1 7 1 92 0 8 03 1 2 1 40 6 4 20 3 7 60 2 7 61 7 0 92 3 2 61 6 0 5 1 51 8 3 2O 9 3 20 8 2 81 9 6 52 2 1 33 6 6 4 1 61 1 1 7O 5 9 70 5 3 31 8 7 l 2 0 9 62 7 9 2 1 7O 4 0 0 0 2 2 l O 1 8 4 1 8 0 62 1 7 41 0 0 0 1 8O 8 2 80 4 4 2O 3 7 31 8 7 52 2 2 01 6 5 6 1 90 8 9 50 5 0 20 4 3 31 7 8 42 0 6 72 2 3 7 2 00 7 2 20 4 1 20 3 1 21 7 5 42 3 1 41 8 0 5 2 lO 4 9 4O 3 0 3O 2 0 41 6 3 32 4 2 21 2 3 5 2 20 5 2 2O 2 9 lO 2 4 81 7 9 62 1 0 51 3 0 5 2 30 3 0 80 1 8 8O 1 4 61 6 3 62 1 1 07 7 0 2 40 6 2 2O 3 2 2O 2 9 51 9 3 22 1 0 81 2 4 4 2 50 3 4 lO 2 1 60 1 4 71 5 7 92 3 2 08 5 2 2 6 O 8 3 90 4 9 4O 3 6 81 6 9 82 2 8 02 0 9 7 1 2 父 母本 3 1 4 F 代分离群体感白粉病单株 1 5 2 6 F 代分离群 体抗白粉病单株 la n d2 p a t e m it ya I l dm a t e m it y r e s p e c t iv e l y 3 1 4 p o w d e r yd is e a s e s u s c e p t ib l ep l a n t s 15 2 6 p o w d e T y d is e a s e r e s is t a n tp l a n t s A B Ml2 3 4l234l2 3 4Ml2 3 4l2 C 34 1 2 3 4M1234I2 3 4I2 3 4 图3S R A P P C R 优化体系验证的扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 F ig 3E l e c 仃o p h o r c s is 锄a l y s e so f p r o d u c t sa m p l if ie db yS 凡廿 P C RiI la g a r o s eg e l s A 苦瓜父本M c l 8 B F 2 代分离群体抗自粉病单株D N A 混合池 c F 代分离群体感白粉病单株D N A 混合池 M 2k bD N A 工丑d d e r M a r k e r 1 4 弓 物对M E 9 E M l l M E 3 E M 3 M E l l E M l l M e l 8 E M l 8 A P a t e m 时M C l 8o f b it t e r m e l o n B M ix e d D N A o f p o w d e r y d is e a s e r c s is t 粕t p l a n t s o fF 2s e g r e g a t io n p o p u l a t io n C m i e d D N A o f p o w d e r y d is e a s e s u s c 印t ib l e p l a n t s o f F 2s e 铲e g a t io n p 叩u l a t io n M 2 k b D N A L a d d e r M a r k e r l 4 M E 9 E M l l M E 3 E M 3 M E l l E M l la I l d M E l 8 E M l 8 r e s p e c t iv e l y 3 讨论 随着现代分子生物学技术的不断进步 基于D N A 的分子标记技术得到了飞速发展 并在许多植物研究 上成功开发和应用 岳思君等 2 0 0 5 尤其是s s R A F L P s 鼬垤等一些操作简便 标记高共显性 产量 高 重复性好 经济适用的D N A 分子标记技术广泛应 用于植物遗传多样性分析 辅助育种 差异基因筛选 基因定位和比较基因组学等方面研究 王芙蓉等 2 0 0 2 柳李旺等 2 0 0 4 这些D N A 分子标记的成功开 发与优化 与相关P c R 扩增程序和反应体系密切相 关 前人研究结果 L ia n dQ u ir o 2 0 0 1 郭大龙等 2 0 0 8 表明 S 黜廿等技术的P c R 扩增程序与本研究所 采用程序基本相同 在扩增程序已确定的情况下 若 是同一台P c R 仪 通常能够获得较为稳定的P c R 产物 但是反应体系对P C R 产物稳定产出的影响很大 因作 物不同而异 李晓慧等 2 0 0 7 柴丹丹等 2 0 0 8 刘泽发 等 2 0 0 8 江海坤等 2 0 1 1 李莲芳等 2 0 1 1 也可能因 9 0 2 南方农业学报 P C R 仪不同而不同 在西瓜研究中 李晓慧等 2 0 0 7 江海坤等 2 0 1 1 认为在T c 一5 1 2P c R 扩增仪上扩增 1 0 0 肛L 反应体系比较经济节省 在苦瓜研究中 郭大 龙等 2 0 0 8 使用2 0 O 斗L 的反应体系能获得理想的差 异产物 其优化获得的5 个因素浓度分别为D N A5 0 n 此 d N T P0 0 5m m o l L M 矿2 5m m o 此 引物0 6 斗m o l L 乃qD N A 聚合酶0 0 8 8U 斗L 本研究利用2 0 O L 反应体积进行扩增 但与郭大龙等 2 0 0 8 的结果有 所不同 优化的5 个因素浓度分别为D N A1 on 斗L 0 1 3m m o l Ld N T P M 矿1 5m m o 儿 引物o 5 斗m o 儿 0 0 7 5U 斗L 而qD N A 聚合酶 除d N T P 含量较低外 其 他因素浓度均较高 这可能与苦瓜品种D N A 提取质量 T a qD N A 聚合酶质量和P C R 仪器及实验环境不同有关 因此 在开展相关D N A 分子标记技术应用时 首先要对 P C R 体系进行优化 其中正交设计L 4 5 方案是减少试 验处理数的最常用方案 较单因素优化有更高的准确性 4 结论 本研究结果表明 用4 对引物对验证优化的 s 谨 P C R 体系 其重复性好 不同苦瓜材料间无明显 的多态性 适用于苦瓜抗白粉病的s 凡心分子标记的 筛选 参考文献 柴丹丹 陈书霞 孟焕文 程智慧 李亚利 2 0 0 8 黄瓜 s R A P P C R 反应体系的建立 J 西北农业学报 1 7 3 2 7 4 2 7 9 C a iDD C h e nSX M e n gHW C h e n gZH YL l2 0 0 8 E s t a b I is h m e n to fS R A P P C Rr e a c t io ns v s t e minc u c u m b e r J1 A c t aA 两c u l t u r a eB o r e a l i一0 c c id e n t a l isS in ic a 1 7 3 2 7 4 2 7 9 高志民 范少辉 高健 李雪平 蔡春菊 彭镇华 2 0 0 6 基 于C T A B 法提取毛竹基因组D N A 的探讨 J 林业科学 研究 1 9 6 7 2 5 7 2 8 G a oZM F a l lSH G a o J XP C a iCJ P e n gZH2 0 0 6 E x t r a c tg e n o m icD N Af m mP b y o s t a c y se d u sb vC T A B b a s e dm e t h o d lJ F b r e s tR e s e a I c h l9 6 7 2 5 7 2 8 郭大龙 吴正景 郑玉萍 韩璐 齐庆 2 0 0 8 苦瓜S R A P 反 应体系的建立与优化 J 安徽农业科学 3 6 1 8 7 5 8 3 7 5 8 5 G u oDL W uZJ Z h e n gYP H a nL Q iQ 2 0 0 8 E s t a b l is h m e n ta n do p t im iz a t io no fS R A Pa m p l if ic a t io ns v s t e min b it t e rm e l o n M o n o I d ic ac 删刀打a jL 1JJ J o u m a lo fA n h u iA 丽c u l t u r a lS c ie n c e s 3 6 1 8 7 5 8 3 7 5 8 5 景然 陈新娟 朱育强 张鹏 张玉琼 周胜军 2 0 1 1 黄瓜 白粉病抗性序列相关扩增多态性的分子标记研究 J 浙 江大学学报 农业与生命科学版 5 5 4 3 8 7 3 9 2 J in gR C h e nXJ Z h uYQ Z h a n gP Z h a n gYQ Z h o uSJ 2 0 1 1 I d e n t m c a t io n0 fS R A Pm o l e c u l a rm a r k e r sl in k e dt o p o w d e n rm il d e wr e s is t a n c einc u c u m b e r IJj J o u m a lo fZ h e iia n gU n iv e r s it v A g r ic u l t u r ea n dL if eS c ie n c e s 5 5 4 3 8 7 3 9 2 江海坤 王明霞 严从生 王艳 马绍錾 董言香 方凌 张 其安 2 0 1 1 小型西瓜S R A P 技术体系优化 J 中国农学 通报 2 7 2 8 2 4 0 2 4 4 J ia n gHK W a n gMX Y a nCS W a n gY M aSJ D o n gY X F a n gL Z h a n gOA 2 0 11 0 p t im iz a t io no fS R A Pr e a c t io ns y s t e mo nm in i w a t e 珊e l o nlJj C h in e s eA g I ic u l t u r a l S c ie n c eB u U e t in 2 7 2 8 2 4 0 2 4 4 柳李旺 龚义勤 黄浩 朱献文 2 0 0 4 新型分子标记 s R A P 与T R A P 及其应用 J 遗传 2 6 5 7 7 7 7 8 1 uLW G o n gYQ H u a n gH Z h uxW 2 0 D 4 N o v e l m o l e c u l a rm a r k e rs v s t e m S R A P A N DT R A Pa n dt h e ir a p p l ic a t io n lJJ H e r e d it a s 2 6 5 7 7 7 7 81 李莲芳 郭爽 林鉴荣 2 0 1 1 丝瓜s R A P 反应体系的建立与 优化 J 北方园艺 1 5 1 6 0 1 6 2 L iLF G u oS b nJR 2 0 1 1 E s t a b l is h m e n ta n do D t im iz a t io n o fS R A Pr e a e t io ns y s t e mj nl o o f a hJI N o n h e mH o r t ic u l t u r e 1 5 1 6 0 1 6 2 李巧燕 林瑞庆 朱兴全 2 0 0 6 s R A P 分子标记及其应用概 述 J 热带医学杂志 6 4 4 6 7 4 6 9 L iQY L inRQ Z h uXQ 2 0 0 6 R e v ie wo nS R A Pm o l e c u l a r m a r k e ra n dit sa p p l ic a t io n l J j J o u m a lo fT r o p ic a lM e d ic in e 6 4 4 6 7 4 6 9 刘泽发 孙小武 罗伏青 张奠 寇明明 董亚静 2 0 0 8 南 瓜s R A P 扩增体系与扩增程序的优化 J 西北农业学报 1 7 6 1 4 8 一1 5 2 1 8 3 uZF S u nXW L u oFQ Z h a n gY K o uMM D o n gYJ 2 0 0 8 O p t im iz a t io no fS R A Pr e a c t io ns v s t e mins q u a s hJJ A c t aA g r ic u l t u r eB o r e a l i O c c id e n t a d is S in ic a 1 7 6 1 4 8 1 5 2 1 8 3 李晓慧 王从彦 张四普 常高正 2 0 0 7 西瓜s R A P P C R 程 序和体系优化 J 安徽农业科学 3 5 2 7 8 4 6 卜8 4 6 3 L iXH W a n gCY Z h a n gSP C h a n gGZ 2 0 0 7 O p t im iz a t io n o fS R A P P C Rp r o 肿ma n ds y s t e mina n l J 口u sb n a f u s J J o u m a lo f A n h u iA 和c u l t u r a ls c ie n c e s 3 5 2 7 8 4 6 l 8 4 6 3 王芙蓉 刘勤红 刘任重 张军 2 0 0 2 农作物遗传育种中的 分子标记及其应用 J 山东棉业 1 5 6 W a n gFR L iuQH L iuRZ Z h a n gJ 2 0 0 2 M o I e c u I a r m a r k e ra n dit sa p p l ic a t io ning e n e t icb r e e d in go fc m p s JJ S h a n g d o n gC o t t o n s 1 5 6 王文桥 张小风 韩秀英 马志强 2 0 l o 我国北方蔬菜病害 抗药性问题及治理对策 J 中国蔬菜 2 3 2 0 一2 3 W a n gWQ z h a n gXF H a n gXY M azQ 2 0 1 0 P e s t ic id e r e s is t a n tp r D b I e m so fv e g e t a b l ed is e a s einN o r t h