稻曲病菌薄壁分生孢子产孢平板培养基的筛选.pdf

49卷南 方 农 业 学 报 68 稻曲病菌薄壁分生孢子产孢平板培养基的筛选 蒲相君 王忠文 杨平 张丽丽 张君成 广西大学 农学院 南宁530004 摘要 目的 分析平板培养基的组分构成对稻曲病菌薄壁分生孢子形成的影响 为薄壁分生孢子的制备培养提 供便捷的技术手段 方法 以4个常规稻曲病菌株Uv 34 Uv 105 Uv 110和Uv 111为试验材料 采取常规的固体培养 技术程序 分别测试马铃薯蔗糖琼脂培养基 PSA 的马铃薯含量及蔗糖含量对薄壁分生孢子形成的影响 在水 非 糖 和4种糖 蔗糖 核糖 木糖和山梨糖 与马铃薯组配形成的固体培养基 PA PSA PRA PXA和PSoA 上的产孢量 在固体培养基上形成孢子数量的时间变化动态及在PA固体培养基上4个菌株的产孢表现 结果 在PSA培养基中 蔗 糖含量为10 g L时产孢量最高 1 69 106个 mL 马铃薯含量以50 0 g L时的产孢量最高 1 18 106个 mL 在PA PSA PRA PXA和PSoA等平板培养基上 菌株的产孢量分别为6 98 106 4 63 106 11 92 106 0 84 106和0 01 106 个 mL 在15 d的连续培养中 于PSA培养基上培养5 d后产孢量开始大幅下降 而在PA和PRA培养基上菌株产孢量 基本稳定或保持上升趋势 在PA培养基上 4个供试稻曲病菌株均能正常大量产孢 结论 稻曲病菌能在含马铃薯 的常规固体培养基上产孢 PA是日常制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的简单易用培养基 PRA是制备培养薄壁分生 孢子的高产培养基 关键词 稻曲病菌 薄壁分生孢子 产孢 培养基 中图分类号 S432 1文献标志码 A文章编号 2095 1191 2018 01 0068 06 收稿日期 2017 08 16 基金项目 国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设项目 nycytxgxcxtd 04 18 2 广西自然科学基金项目 2011GXNS FA018068 作者简介 为通讯作者 张君成 1962 教授 主要从事水稻病害研究工作 E mail jczhang 蒲相君 1993 研究 方向为植物病理学 E mail xiangjun128 Screening plate media for sporulation of thin walled conidia of Ustilaginoidea virens Cooke Takahashi PU Xiang jun WANG Zhong wen YANG Ping ZHANG Li li ZHANG Jun cheng College ofAgriculture Guangxi University Nanning 530004 China Abstract Objective Effects of component and content of plate medium on sporulation of thin walled conidia of Ustilaginoidea virens Cooke Takahashi was examined in order to provide an easy and rapid technical way for production of thin walled conidia Method Four conventional U virens strains Uv 34 Uv 105 Uv 110 and Uv 111 were used as materials Using common plate culture technical procedure effects of both potato content and sucrose content in medium potato sucrose agar PSA on sporulation of thin walled conidia was determined conidia yield of strains grown on plate medium PA PSA PRA PXA and PSoA of potato mixed with water no sugar and four sugars sucrose ribos xylose and sorbose was observed variation trend of conidia yield produced on plate medium due to the change of culture time was recorded and sporulation of four strains on plate medium of potato agar PA was observed Result On PSA medi um the top yield 1 69 106conidia mL of conidia was obtained from 10 g L of sucrose and top yield 1 18 106conidia mL of conidia was obtained from 50 g L of potato On plate media PA PSA PRA PXA and PSoA conidia yields were 6 98 106 4 63 106 11 92 106 0 84 106 and 0 01 106conidia mL Conidia yield produced on PSA plate media dropped sharply 5 d after culture but conidia yield produced on both PA plate media and PRA plate media remained steady or increasing trend within a culture duration of 15 d All four strains produced conidia normally and abundantly on PA plate media Conclusion U virens can produce conidia on conventional plate media with potato on PA is a medium which is quick and easy to use in daily work for the production of thin walled conidia of U virens PRA is a medium to produce thin walled conidia with high yield Key words Ustilaginoidea virens Cooke Takahashi thin walled conidia sporulation medium 南方农业学报Journal of Southern Agriculture2018 49 1 68 73 ISSN 2095 1191 CODEN NNXAAB DOI 10 3969 j issn 2095 1191 2018 01 11 1期 69 0引言 研究意义 植物病原真菌的繁殖体在病害发 生与流行中发挥着重要作用 因而在植物病害研究 中经常使用繁殖体材料来研究病菌 寄主的互作关 系 以及探索病害的防控途径 稻曲病是国内外水 稻生产的重大病害之一 其病原菌稻曲病菌 Usti laginoidea virens Cooke Takahashi 可产生子囊孢 子 厚壁分生孢子和薄壁分生孢子3种形态的繁殖体 张君成等 2003 张俊喜等 2016 这3种形态孢子 均能侵染水稻致病 可用于稻曲病的相关研究 研 究工作使用的孢子材料一般需通过试验培养等方法 获取 但实验室内培养获取稻曲病菌子囊孢子尚无 成功先例 培养获取厚壁分生孢子也存在较大的技 术困难 因而当前的相关研究主要使用薄壁分生孢 子 俞咪娜等 2013 Zheng et al 2016 Zheng et al 2017 培养获取病原菌孢子最关键的技术物质是 培养基 适宜的培养基能起到事半功倍的效果 因 此 探索稻曲病菌薄壁分生孢子制备的适合培养基 可为薄壁分生孢子的制备培养提供可靠便捷的技术 手段 进而保证相关研究工作的顺利开展 前人研 究进展 有关稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养 早 期有采用液体培养基振荡培养方法 陆凡等 1996 和静止培养方法 王疏等 1998 的报道 当前多数使 用液体培养基振荡培养方法 Han et al 2015 王宇 秋等 2016 Yu et al 2016 即使开展产孢基因研究 或致病相关基因研究 涉及的孢子培养也是采用液 体培养基振荡培养方法 黄磊等 2013 L et al 2016 此外 有研究报道振荡培养的某些操作因素 与产孢量有关 时婷婷等 2015 至今报道振荡培 养方法所用的培养基几乎都是PS 马铃薯蔗糖 液体 培养基 该培养基中的主要组分为马铃薯 最近有 比较各种植物组织组配的培养基对产孢量的影响报 道 结果仍是马铃薯组织与蔗糖组配的培养液 PS 更适宜薄壁分生孢子的形成 时婷婷等 2017 可 见 稻曲病菌薄壁分生孢子制备培养技术至今仍是 采用PS液体培养基的振荡培养方法 其缺点主要是 培养产物含有大量的菌丝体 且培养工作需要配备 振荡培养设备 许多植物病原菌孢子的制备培养是 采用便捷可靠的固体平板培养方法 Ribas et al 2016 Wiseman et al 2016 高杨杨等 2017 Guijar ro et al 2017 然而针对稻曲病菌尚未发现应用固 体平板培养方法的报道 本研究切入点 笔者在日 常工作中发现 稻曲病菌也能在固体平板培养基上 生长发育形成薄壁分生孢子 且培养基的营养状况 对孢子的形成影响较明显 但哪些营养物质有利于 孢子形成尚不清楚 拟解决的关键问题 用常规稻 曲病菌菌株材料和常规的平板培养技术程序 通过 测定常规PSA培养基各组分的含量与稻曲病菌产孢 量的关系 比较蔗糖 核糖 木糖和山梨糖等糖物质 对产孢量的影响 观察稻曲病菌在平板培养基上的 产孢动态等 寻找能取得较高孢子产量的培养基营 养组成 为稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养提供 适宜平板培养基 1材料与方法 1 1试验材料 供试常规稻曲病菌菌株Uv 34 Uv 105 Uv 110 和Uv 111 圴为广西大学植物病理学实验室保存的 菌株 1 2试验方法 1 2 1移植用孢子液制备取试管斜面培养的供 试菌株 移植少量菌丝团入PS液体培养基 马铃薯 100 g 蔗糖10 g和蒸馏水1000 mL 置于摇床进行 150 r min 28 培养7 d 然后用1层灭菌纱布过滤培 养产物混合液 除去菌丝体 将仅含孢子的液体离心 沉淀 用无菌水将沉淀孢子悬浮洗涤1次 重新离心 沉淀 再用无菌水将沉淀孢子悬浮和稀释 并用血球 计数板进行计数 再用无菌水调配成106个 mL的孢 子液 分装于5 mL冷冻管保存于25 恒温箱备用 1 2 2PSA培养基蔗糖含量对产孢量的影响用 马铃薯煮出液 蔗糖 琼脂和蒸馏水配制成背景基质 为马铃薯100 0 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 mL 而蔗 糖含量分别为5 0 10 0 20 0和40 0 g L的培养基 常 规高温高压灭菌后倒培养平板 植入菌株Uv 111贮 备孢子液50 L进行产孢培养 1 2 3PSA培养基马铃薯含量对产孢量的影响用 马铃薯煮出液 蔗糖 琼脂和蒸馏水配制成背景基质 为蔗糖10 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 mL 分别含马铃 薯50 0 100 0 200 0和400 0 g L煮出液的培养基 常 规高温高压灭菌后倒培养平板 植入菌株Uv 111贮 备孢子液50 L进行产孢培养 1 2 4不同糖化合物培养基对产孢量的影响先 用蒸馏水将糖化合物配成100 g L的糖溶液 用细菌 过滤器过滤灭菌 再将灭菌糖溶液分别与经高温高 压灭菌的马铃薯琼脂基质混合 形成背景均是马铃 薯琼脂但糖化合物不同的培养基 配比为糖化合物 10 0 g 马铃薯100 0 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 mL 其中糖化合物分别为水 非糖 蔗糖 核糖 木糖和 山梨糖 对应形成的培养基分别为马铃薯琼脂 蒲相君等 稻曲病菌薄壁分生孢子平板培养的产孢培养基筛选 49卷南 方 农 业 学 报 70 0 7 8 c 1 6 9 a 1 4 8 a b 1 1 9 b 0 0 0 0 4 0 0 8 0 1 2 0 1 6 0 2 0 0 5 01 0 02 0 04 0 0 PA 马铃薯蔗糖琼脂 PSA 马铃薯核糖琼脂 PRA 马铃薯木糖琼脂 PXA 和马铃薯山梨糖琼 脂 PSoA 倒培养平板后植入菌株Uv 111贮备孢子 液35 L进行产孢培养 1 2 5孢子产量与培养时长的关系按1 2 4方法 操作配备背景均为马铃薯琼脂 糖化合物分别为水 非糖 蔗糖和核糖的培养基 倒培养平板后植入菌 株Uv 111贮备孢子液35 L进行产孢培养 分别在移 植培养5 10和15 d后 每种糖培养基处理各取出3皿 重复 测定新一代孢子产量 1 2 6不同菌株在PA培养基上的产孢表现用马 铃薯100 0 琼脂20 g 蒸馏水1000 mL配备PA培养 基 倒培养平板后 分别移植入菌株Uv 34 Uv 105 Uv 110和Uv 111的孢子液50 L进行产孢培养 各 菌株移植用的孢子液的贮备时长不等同 1 2 7产孢培养与后代孢子数量测定所有培养 基均用9 cm培养皿倒平板 所有测试处理均设3次重 复 植入相应的贮备孢子液后 用T形玻棒将孢子液 均匀涂抹于平板面上 然后将测试平板转置28 的 恒温培养箱 除测试项有说明外 均为培养5 d后取 出测定新一代孢子产量 每皿平板加入15 mL蒸馏 水 用小毛刷刷下平板表面孢子 用血球计数板检测 所得孢子液的孢子数量 每重复皿观察80个中方格 的孢子数 并换算成每毫升孢子液的孢子数量 2结果与分析 2 1PSA培养基蔗糖含量对产孢量的影响 在马铃薯琼脂背景中添加不同含量的蔗糖 形 成4个蔗糖含量处理的培养基 移植入菌株Uv 111进 行产孢培养 结果 图1 发现蔗糖含量为10 0 g L的 培养基产孢量最高 为1 69 106个 mL 显著高于蔗 糖含量为5 0和40 0 g L的培养基的产孢量 P0 05 下同 表明PSA培养基的蔗糖 含量对稻曲病菌薄壁分生孢子产量影响较明显 2 2PSA培养基马铃薯含量对产孢量的影响 用马铃薯与背景相同的蔗糖琼脂培养基组配 形成不同马铃薯含量的培养基 移植入菌株Uv 111 进行产孢培养 结果 图2 发现马铃薯含量为50 0 g L的培养基产孢量最高 为1 18 106个 mL 显著高于 马铃薯含量为200 0和400 0 g L培养基的产孢量 但 与马铃薯含量为100 0 g L的培养基产孢量差异不显 著 表明PSA培养基中马铃薯含量对稻曲病菌薄壁 分生孢子产量影响较明显 且在测试范围内马铃薯含 量越少越好 2 3不同糖化合物培养基对产孢量的影响 在马铃薯琼脂背景中添加不同的糖组分 形成 5种处理培养基 菌株Uv 111在5种处理培养基中均 能生长形成小菌落 但小菌落的产孢量表现差异较 明显 由图3可知 添加蔗糖的培养基 PSA 产孢量 为4 63 106个 mL 添加核糖的培养基 PRA 产孢量 11 92 106个 mL 远高于添加蔗糖的培养基产孢 量 添加山梨糖的培养基 PSoA 产孢量非常少 0 01 106个 mL 而没有添加任何糖的PA培养基产 孢量 6 98 106个 mL 显著高于蔗糖处理 以水处理 作参照 含核糖的培养基能大幅增加产孢量 而含山 梨糖 木糖和蔗糖的培养基不利于孢子形成 表明 不同糖化合物对稻曲病菌薄壁分生孢子的形成发育 有重大影响 图 1菌株Uv 111在不同蔗糖含量PSA培养基上的产孢量 Fig 1Conidia yield of strain Uv 111 on PSA media with di fferent sucrose contents 图柱上不同小写字母表示差异显著 P 0 05 图2 图3和图5同 Different lowercase letters on the bar represented significant difference P 0 05 The same was applied in Fig 2 Fig 3 and Fig 5 产孢量 106个 mL Conidia yield 106conidia mL 蔗糖含量 g L Sucrose content 1 1 8 a 0 8 8 a b 0 8 5 b 0 3 7 b c 0 0 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 5 0 01 0 0 02 0 0 04 0 0 0 图 2菌株Uv 111在不同马铃薯含量PSA培养基上的产孢量 Fig 2Conidia yield of strain Uv 111 on PSA media with di fferent potato contents 产孢量 106个 mL Conidia yield 106conidia mL 马铃薯含量 g L Potato content 1期 71 1 1 9 2 a 1 2 1 9 a 1 4 2 7 a 6 9 8 a 8 8 9 a 7 8 1 a 4 6 3 a 1 3 3 b1 2 1 b 0 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 5 d1 0 d1 5 d 核糖 水 蔗糖 0 0 1 d 0 8 4 d 4 6 3 c 6 9 8 b 1 1 9 2 a 0 0 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 水蔗糖核糖木糖山梨糖 产孢量 106个 mL Conidia yield 106conidia mL 培养天数 d Culture days 产孢量 106个 mL Conidia yield 106conidia mL 核糖 Ribose 水 Water 蔗糖 Sucrose 51015 2 4孢子产量与培养时长的关系 在糖化合物为水 非糖 蔗糖和核糖的培养基 上 随培养时长的增加 菌株Uv 111的产孢量变化存 在明显差异 在含蔗糖培养基 PSA 上 培养5 d的 产孢量为4 63 106个 mL 随着培养时间的延长 产 孢量大幅下降 10 d后产孢量只有1 33 106个 mL 显 著低于培养5 d时的产孢量 而在含核糖 PRA 或水 PA 的培养基上 培养5 15 d的产孢量基本维持不 变 或稍有上升的趋势 图4 观察相应的产孢菌落 外观 在含蔗糖培养基上培养10 d后可见浓密的非 产孢菌丝 而在含核糖或水处理的培养基上培养10 15 d后未发现非产孢菌丝 表明在不同的糖营养培 养基上稻曲病菌的产孢习性不同 2 5不同菌株在马铃薯琼脂培养基上的产孢表现 在PA培养基上 4个供试菌株均能形成大量的 后代孢子 但菌株间的产孢量存在明显差异 其中以 UV 111的产孢量最多 显著高于其他3个菌株的产孢 量 图5 菌株间产孢量存在差异的原因 一是菌株 本身的产孢习性存在差异 二是初始移植菌体 活性 孢子数量 存在差异 3讨论 PSA和PS同属植物病理学日常培养的常用培养 基 前者为固态 后者为液态 两者主要组分均为马 铃薯和蔗糖 其常规用量是马铃薯200 g L 蔗糖20 g L 当前稻曲病菌薄壁分生孢子制备惯用的液体 培养均为常规用量的PS培养基 俞咪娜等 2013 Han et al 2015 Zheng et al 2017 未见其2个主要 组分与产孢数量关系的研究报道 本研究测定PSA 组分对稻曲病菌产孢的影响 发现组分马铃薯为50 g L 蔗糖为10 g L的平板培养基稻曲病菌形成的孢 子数量最多 说明该培养基的常规用量并不是稻曲 病菌产孢的最适用量 至少不是平板培养基的最适 用量 当前稻曲病菌薄壁分生孢子制备多习惯应用 蔗糖组配的PS培养基 未见有关研究其他糖物质对 产孢数量的影响报道 本研究测试发现 在核糖组 配的培养基上 稻曲病菌形成的孢子数量远高于在 蔗糖组配的PSA培养基 表明PRA培养基更适合稻 曲病菌产孢 试验时发现 没有额外添加糖物质的 PA培养基比常规PSA培养基更适合菌株产孢 与当 前惯用的液体培养的表现不一致 在液体培养技术 中 菌株在PS培养液的产孢量远高于没有添加蔗糖 的马铃薯培养液的产孢量 时婷婷等 2017 跟踪产孢过程发现 在常规的PSA培养基上培 养5 d后 稻曲病菌的产孢量呈大幅下降趋势 意味 着在实际工作中应考虑培养时间问题 时间过长不 1 6 0 c 4 1 1 b 1 3 4 c 5 0 2 a 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 U V 3 4U V 1 0 5U V 1 1 0U V 1 1 1 图 5不同菌株在PA培养基上的产孢量 Fig 5Conidia yield of different strains on potato agar PA medium 菌株 Strain 产孢量 106个 mL Conidia yield 106conidia mL 图 3菌株Uv 111在不同糖化合物培养基上的产孢量 Fig 3Conidia yield of strain Uv 111 on media with different carbohydrates 糖化合物 Carbohydrate 图 4在不同培养基及不同培养时长条件下菌株Uv 111的 产孢量 Fig 4Conidia yield of strain Uv 111 on different media with different growth periods 同一曲线上不同小写字母表示差异显著 P 0 05 Different lowercase letters on the same polyline represented significant difference P 0 05 蒲相君等 稻曲病菌薄壁分生孢子平板培养的产孢培养基筛选 49卷南 方 农 业 学 报 72 利于获得高产的制备效果 而在PA培养基和PRA培 养基上 稻曲病菌产孢量在15 d内基本保持平稳或 增长的趋势 这种表现有利于实际工作应用时不必 特别注意培养的时效问题 使得孢子的准备工作与 需要使用孢子材料的研究工作环节比较容易衔接 固体平板培养是普通实验室的常规技术 其操 作性和便捷性比液体培养优越 长期以来稻曲病菌 一直使用液体培养技术制备培养薄壁分生孢子 本 研究结果表明 稻曲病菌在平板培养基上能形成大 量孢子 可为稻曲病菌孢子制备培养提供一种更为 便捷的技术 特别明显的是PA培养基 该培养基是 日常使用的PDA 马铃薯葡萄糖琼脂 或PSA培养基 的基本组分 其容易配制且使用方便 同时 在PA培 养基上稻曲病菌的产孢量比PSA培养基上的更高 更稳定 经测试多个菌株均能正常产孢 综合技术操 作性及产孢表现 可认为PA是稻曲病菌薄壁分生孢 子制备培养简单易用的理想培养基 而PRA培养基 是本研究测试产孢量最高的培养基 可作为稻曲病 菌产孢培养的高产培养基 有利于产孢量较低的菌 株的孢子制备培养 需要说明的是 核糖 木糖和山梨糖的高温灭 菌培养基能强烈抑制稻曲病菌薄壁分生孢子的萌发 张君成等 2009 笔者研究发现这3种糖化合物本 身对孢子萌发并无抑制作用 孢子在这3种糖的非高 温灭菌培养基上可正常萌发生长并形成小菌落 产 生抑制作用是由于高温对糖作用的后果 因此实际 使用马铃薯核糖培养基时核糖组分不能采取高温 灭菌 4结论 稻曲病菌在含马铃薯的常规固体平板培养基 上能形成大量的薄壁分生孢子 马铃薯琼脂培养基 PA 是日常制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的简 单易用培养基 马铃薯核糖琼脂培养基 PRA 是制 备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的高产培养基 参考文献 高杨杨 禾丽菲 李北兴 林琎 慕卫 刘峰 2017 山东省 辣椒炭疽病病原菌的鉴定及高效防治药剂的筛选 J 中国农业科学 50 8 1452 1464 Gao Y Y He L F Li B X Lin J Mu W Liu F 2017 Identification of the pathogen causing Pepper Anthracnose in Shandong Province and screening of highly effective fungicides J Scientia Agricultura Sinica 50 8 1452 1464 黄磊 俞咪娜 胡建坤 于俊杰 尹小乐 聂亚锋 陈志谊 刘永锋 2013 稻曲病菌突变体B 726 生物学性状分析 及其T DNA 插入位点侧翼序列的克隆 J 中国农业科 学 46 16 3344 3353 Huang L Yu M N Hu J K Yu J J Yin X L Nie Y F Chen Z Y Liu Y F 2013 Analysis of biological phenotypes and molecular cloning of T DNA integration flanking sequences of Ustilaginoi dea virens mutant strain B 726 J Scientia Agricultura Sinica 46 16 3344 3353 陆凡 陈志谊 陈毓苓 史阿宝 王法明 张宏图 1996 稻 曲病菌的生物学特性及其侵染循环中某些未确定要点 的研究 J 江苏农业学报 12 4 35 40 Lu F Chen Z 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