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核磁共振波谱学2009 3 参考书 HorstFriebolin BasicOne andTwo DimensionalNMRSpectroscopyJamesKeeler UnderstandingNMRSpectroscopyMalcolmH Levitt SpinDynamics BasicsofNuclearMagneticResonance毛希安 现代核磁共振实用技术及应用裘祖文 核磁共振波谱马礼敦 高度结构分析 核磁共振的基本原理化学位移自旋 自旋耦合弛豫双共振技术和NOE效应多脉冲实验二维核磁共振波谱简介 前言 1 核磁共振 nuclearmagneticresonance NMR 是电磁波 无线电波 与原子核自旋相互作用的一种基本物理现象 所涉及的电磁波为无线电波 频率为数兆赫到1千兆赫之间 所研究的对象是为原子核 因此 用NMR所进行的研究一般是在原子水平上 而原子是化学元素保持其基本属性的最小单位 所以 NMR是对组成物质的最基本单元所进行的研究 在所有的已发现的共振现象中 NMR波谱学具有最高的频率分辨率 前言 2 OrientationandlocationofCM15inDPCmicellesobtainedfromallmeasuredPREvaluesusingtheprogramParaposasexplainedinthetext Thepeptideisdrawnasball and stickmodelscolor codedwithPREsgoingfromblue lowvalues tored highPREs Thecenterofthemicelleisshownasagreensphere andtheradiusoftheclosestapproachingparamagneticcentersisdepictedbyadottedline ThemicelleisindicatedbyblueDPCmoleculeswiththephosphategroupscoloredred J Phys Chem B ArticleASAP DOI 10 1021 jp808501x PublicationDate Web 03March2009 核自旋实际上已成为科学家探讨物质世界的 探针 这些 探针 极端定域 能够详尽地报告它们自己以及近邻的状态核变化 核自旋的共振频率 弛豫速度 偶极 偶极和标量 耦合相互作用能够分别提供分子中原子核所处位置的化学环境 运动状态和分子间的相互作用等密切相关的结构和动力学信息 NMR技术已经发展成为研究液态分子的极为重要的手段 对于溶液中蛋白质和DNA构象的研究 NMR是目前唯一的方法 前言 3 核磁共振是1946年由美国斯坦福大学的F Block W W Hansen和M E Packard以及哈佛大学的E M Purcell H C Torrey和R V Pound各自独立发现的 两人因此获得1952年诺贝尔物理学奖 50年间已有12位科学家因对核磁共振的杰出贡献而获得诺贝尔奖 1991年诺贝尔化学奖单独授予瑞士科学家Ernst 表彰他对NMR波谱学实现和发展傅里叶变换 多维技术的贡献 前言 3 2002年的诺贝尔化学奖的一半授予瑞士科学家W thrich 表彰他用多维NMR波谱学在测定溶液中蛋白质结构的三维构象方面的开创性贡献 2003年的诺贝尔生理和医学奖授予美国科学家Lauterbur和英国科学家Mansfield 表彰他们在磁共振成像 magneticresonanceimaging MRI 技术领域的突破性成就 后三次诺贝尔奖标志着NMR的研究领域已从早期的物理学进入到化学和生命科学的广阔天地 前言 4 在核磁共振波谱法中 用波长10 100m 频率相当于MHz数量级 的电磁波照射样品 由于这范围的电磁波波长较长 而能量较低 不能引起样品中的原子或原子团的振动跃迁 更不能引起价电子的跃迁 但这样波长的电磁波能够与放置在磁场中一定数量样品的原子核相互作用 发生核磁共振跃迁 记录其共振跃迁信号位置和强度 就是核磁共振波谱 什么叫核磁共振 核磁共振的优缺点 优点 缺点 低灵敏度 如何提高灵敏度和分辨率 核自旋在磁场中的运动 1 核自旋在磁场中的运动 2 旋进 当一个原子核的核磁矩处于磁场BO中 由于核自身的旋转 而外磁场又力求它取向于磁场方向 在这两种力的作用下 核会在自旋的同时绕外磁场的方向进行回旋 这种运动称为Larmor进动 又叫旋进 procession 核自旋在磁场中的运动 3 通常定义磁场方向为z轴 核自旋绕z轴旋进的速率 0 旋进频率或旋进角频率 由磁场强度和核自旋的旋磁比 确定 与夹角的大小无关 该旋进频率称v0为Larmor频率 是NMR中最为重要的参数 另外还有一种由外界迫使自旋轴与静磁场方向B0成一角度的运动 此运动称为章动 nutation 原子核的自旋 自旋角动量P 一些原子核有自旋现象 因而具有角动量 h Planck常数 6 6256x10 34Js I 角动量量子数 核自旋量子数 0 1 2 1 3 2 2 6 磁矩和旋磁比 磁矩 和P都是矢量 因此具有方向性 通常情况下 和P的方向是平行的 但在某些情况下 比如15N 29Si 则是反平行的 I等于零的核称为非磁性核 实验中观察不到其NMR信号 由于原子核是带正电的 而带电体的转动必定会产生磁矩 因此每一自旋不为零的原子核本质上可以看成是一个微观磁矩 这就是原子核磁性的起源 微观磁矩 与自旋的关系是 核自旋量子数 I 与原子核质量数 N 原子序数 Z 的关系 虽然所有的原子核都拥有质量和电荷 但并不是所有的核都具有自旋角动量和磁矩 旋磁比 NMR中一些重要的核的性质 恒定磁场B0中的原子核 核磁矩在外磁场中的行为 空间取向量子化 Pz m 具有磁矩的核在外磁场中的自旋取向是量子化的 可用磁量子数m 磁量子数或方向量子数 来表示核自旋不同的空间取向 其数值可取 m I I 1 I 2 I 共有2I 1个取向 角动量P在磁场中空间取向量子化 核磁矩在外磁场中的能级 核磁矩位能 I 1 2和I 1的核在外磁场B0中的Zeeman能级图 在外磁场的作用下 使原来原子核简并的能级分裂成2I 1个能级 这些能级称为Zeeman能级 相邻的两能级之差 外磁场B0中相邻的两能级之差 能级是等距的 其间距与m无关 但和磁场强度成正比 在绝对温度0K时 全部核处于低能态 在无磁场时 二种自旋取向的几率几乎相等 外磁场作用下 原子核自旋取向倾向取低能态 但室温时 热能比原子核自旋取向的能级差高几个数量级 热运动使这种倾向受破坏 热平衡状态时 原子核的磁矩在各能级上的数目分布 布居数 服从Boltzmann分布 Boltzmann分布 1 在质子群中处于高低能态的核各有多少 从上式中可以看出 相邻两能级间粒子布居数之差与磁场强度有关 因此 提高磁场强度 有助于增加灵敏度 Boltzmann分布 2 对于氢 B0 1 41T 共振频率为60MHz 的磁场中 N 0 99999N 高低能态的核数只差10ppm 当B0 7 05T 共振频率为300MHz 时 N 0 99995N 高低能态的核数只差50ppm 当B0 11 75T 共振频率为500MHz N N 相对于热运动的平均能量kBT 能级差 E很小 因此 各能级上粒子的布居数几乎相同 差值在百万分子几 ppm 这也是核磁共振具有较低灵敏度的主要原因 b a 宏观核磁化矢量说明图 核自旋系综的宏观磁化矢量 磁化强度 1 a 没有磁场的情况下 自旋系综中的磁矩的方向是杂乱无章的 因此 对于一个原子核宏观集体而言 观测不到任何宏观的核磁性现象 b 当含有磁性原子核的物质置于均匀的磁场中后 微观磁矩在一定时间内 自旋 晶格弛豫时间 内沿磁场方向排列 从无序变为有序 宏观上形成了原子核的磁化矢量 磁化强度M0 磁化矢量是微观磁矩的统计平均 c 磁矩矢量沿磁场方向的进动使XY平面上的投影相互抵消 由于沿磁场方向能量较低 故核自旋分布较多一些 造成一个沿Z 轴的磁化矢量 核自旋的沿磁场的有序取向与分子在几何空间的有形运动是相互独立的两种运动 不能认为高温时分子的无规运动可以破坏核自旋的有序排列 核自旋系综的宏观磁化矢量 磁化强度 2 c 这里所说的有序只是统计意义的有序 实际上 即使有磁场的存在 系综中任何取向的核自旋都是存在的 自不过沿着磁场方向取向的核自旋的能量最低 因此在系综中具有较大的权重因子 核自旋系统的宏观磁化矢量 2 Curie定律 Curie定律 热平衡时 某一宏观物质特定原子核的磁化强度与单位体积中的原子核数目N 原子核的旋磁比 自旋量子数I 外加均匀磁场的磁感应强度B0和绝对温度T有如下关系 浓度越高 信号强度越大 丰度 1H100 13C1 07 15N0 368 17O0 038 旋磁比 1H26 7 13C6 72 15N 2 71 17O 3 63 高场对于低灵敏度的核很重要 降低温度有利于提高灵敏度 低温探头相当于提高场强 磁场强度B0单位 1T 104Gauss 高斯 一般谈到的谱仪的磁场强度 比如400M 500M 800M的谱仪 一般针对的是1H核在这个磁场中的共振频率 如果是13C谱 31P或其它的核 则需根据其旋磁比来换算 I 1 2时 核自旋体系的能级图 共振条件 1 原子核在磁场中发生能级分裂 在磁场的垂直方向上加小交变电场 如频率为v射 当v射等于核自旋的旋进频率 发生共振 低能态原子核吸收交变电场的能量 跃迁到高能态 称核磁共振 只有当射频场的能量满足相邻两能级的能量差 E时 才能诱导跃迁 a吸收能量的吸收跃迁 e放出能量的辐射跃迁 吸收跃迁和辐射跃迁的几率是相同的 但是由于处于两能级的核自旋的布居数不同 低能级的 态要多于高能级的 态 因此 吸收跃迁占主导 因此 NMR的信号强度与N N 有关 NMR的选择定则 即相邻能级间的单量子跃迁允许 而非相邻能级间的跃迁 即零量子跃迁和双量子跃迁 是禁阻的 饱和现象 当N N 时 发射和吸收过程相互抵消 从而观察不到NMR信号 射频功率越强 体系越快饱和 因此 射频功率不能太强 射频场B1必须垂直于恒定磁场B0 否则无法产生能级间的跃迁 只有当射频频率v1等于Larmor频率vL时 才出现强信号 共振条件 2 共振条件 射频频率与磁场强度Bo是成正比的 在进行核磁共振实验时 所用的磁强强度越高 发生核磁共振所需的射频频率也越高 磁化矢量在磁场中的运动 1 磁化矢量受到激发后 就处于一种不平衡的状态 施加RF脉冲 量子力学 低能级跃迁至高能级 经典力学 磁化矢量偏离B0方向 进行章动 一旦磁化强度开始章动 我们就可以说自旋受到激发 自旋受激发后的状态依赖于章动时间的长短 而章动时间则与章动角互为正比关系 磁化矢量章动示意图 液体高分辨谱仪 tp 2 为10us 固体为3 4us 成像实验时为1ms 磁化矢量的章动是偏离平衡状态的受迫运动 而旋进则是自旋体系在向平衡状态恢复的必然过程 两个过程本质上都是磁化强度的转动过程 偏离平衡态的过程是磁化矢量绕激发场的旋转 而向平衡态恢复过程中的旋进则为磁化矢量绕静磁场的旋转 磁化矢量在磁场中的运动 2 磁化矢量旋进示意图 撤除RF脉冲 量子力学 弛豫过程经典力学 磁化矢量不可能保持静止 而必然要绕着磁场方向z轴进行转动 称为旋进 旋进方向是y x y x y 旋进速率即为核自旋vL的共振频率 一般写成圆频率形式 单位为弧度 秒 射频脉冲 1 矩形脉冲 矩形函数的分解图 对于一个宏观样品来说 即使是同一种核 由于其所处的化学环境不同 它们的共振频率也不相同 根据频谱分析 矩形脉冲实际是由很多频率的正弦波合成的 因此 施加一个矩形脉冲 相当于同时施加许多频率的正弦波 在PFT NMR实验中 除非使用选择性脉冲 一个强的RF脉冲在极短的时间内能够同时激发所有的核 射频脉冲 2 脉冲角度 章动角 脉冲角度指的是脉冲宽度 p和脉冲强度 B1的乘积 脉冲宽度 p一般是数 s 射频脉冲 3 通过RF脉冲的照射 磁化矢量将以RF脉冲的照射方向为轴 在垂直于RF脉冲的照射方向的平面内转动 章动 如使用X 脉冲则磁化矢量将围绕X 轴方向在YZ平面内转动 只要RF脉冲打开 则磁化矢量的章动就不会停止磁化矢量的章动速度取决于脉冲强度脉冲宽度将决定磁化矢量停止的位置 若脉冲角度小 称为小角度激发 若脉冲角度为90 称为90 激发 脉冲角度进行到180 称为自旋反转 磁化矢量在磁场中的运动方程 其中 0可适用于任何角度的激发脉冲 T2是横向磁化强度衰减的特征时间常数 自旋 自旋弛豫时间 T1是纵向磁化强度建立的特征时间常数 自旋 晶格弛豫时间 Cartesian坐标系和旋转坐标系 为了更好的描述与简化所研究的体系而引进旋转坐标系统 旋转坐标系统中的Z 轴与传统的三维坐标系的Z 轴一致 而其X 与Y 轴却以与核磁共振频率相同 Larmor频率 的频率绕Z 轴旋转 在此体系中 核磁矩不在围绕Z 轴旋转而是静止在某一点上 x z y x y z 自由感应衰减 FID 经过脉冲照射后 磁化矢量转到XY平面上并绕Z 轴旋转 由于此转动切割了接受器的线圈 并在接受器的线圈中产生振荡电流 得到一个随时间衰减的信号 即自由感应衰减 FreeInductionDecayFID 此信号并不能象cos函数一样保持同样的振辐持续下去 而是以指数的方式衰减为零 此一现象是由所谓的自旋 自旋弛预造成 T2relaxation 其频率就是Larmor频率 在PFTNMR中 接收线圈与发射线圈是同一线圈 CH3I的90MHz1HNMR谱 22 63MHz13CH3OH13CNMR谱 脉冲Fourier变换核磁共振 1 Fourier变换 通过Fourier变换 可以将时间域函数f t 转变成频率域函数F f 反之亦然 矩形脉冲时域函数 根据Fourier变换理论 宽度为 p的矩形脉冲可以激发范围的频率 因此脉冲越窄 覆盖的频率范围越宽 脉冲Fourier变换核磁共振 2 指数衰减函数的Fourier变换 脉冲Fourier变换核磁共振 3 由于色散线形较宽 而且由正 负两个部分组成 在复杂的图谱中会彼此抵消 使解谱更加困难 因此一般选用吸收线形 吸收线形的半高宽为 1 T2 或 R2 即FID信号衰减地越快 谱线越宽 但是峰的积分面积不变 可以通过积分面积决定观测核的相对数目 相位校正 1 相位偏移 相位偏移分为两类 零级相移 与频率无关 由检波器的参考相位不对引起 一级相移 与频率有关 一般表现为线性关系 主要由以下三种原因引起 激发FID信号的RF脉冲的功率有限 做不到真正均匀地照射谱宽范围 为了避免脉冲泄露和功放的死时间 脉冲后到取数开始之前 不可避免地有一个前延迟时间 为了压低高频噪声 采用电子滤波器 要产生另一种相移和幅度误差 相位校正 2 相位偏移 零级相位校正 相位校正对谱中所有峰都一样 不考虑各个峰频率偏置 相位校正 3 一级相位校正 随着频率的变化改变相位变化的速率 相位校正 4 实验中同时检测到实部和虚部的信号 通过相位校正除去虚部的信息仅留下实部的信息 到纯粹的吸收峰 相位校正 5 a d零级相位校正b e一级相位校正c f零级相位校正 一级相位校正 NMR检测 A 磁化强度矢量 Larmor频率B RF脉冲 脉冲功率 探头 电击放电C 磁化强度矢量进动 旋转坐标系 接收器 前置放大器D 接收器增益值 弛豫时间 T1 T2 E 傅立叶转换 正交检测 频率扫描宽度 折反峰folding 获得NMR信号的基本条件 建立宏观纵向磁化矢量 通过RF脉冲对磁化矢量作用 获得横向磁化矢量 横向磁化矢量旋进 在线圈中产生FID电流 核自旋空间取向和Zeeman能级 射频脉冲 E m B0 相邻两能级之差 E B0 旋转座标系的概念 章动 进动 脉冲傅立叶变换NMR中的几个重要概念 旋磁比 Curie定律 共振条件和NMR选择定则 Boltzmann分布 宏观磁化矢量 相位校正 化学位移 1 屏蔽效应 共振条件 B0一定 大 小 峰向高场移动如 CHBr3 CH2Br2 CH3Br TMS 在磁场中 所有自旋核产生感应磁场 方向与外加磁场相反或相同 使原子核的实际受到的磁场降低或升高 此一现象我们称做屏蔽效应 屏蔽效应是化学位移的根源 化学位移 2 屏蔽常数 化学位移 3 屏蔽常数的影响因素 局部抗磁屏蔽项 局部顺磁屏蔽项 N 邻近基团的磁各向异性 R 芳烃中的环流效应 e 电场效应 i 分子间的相互作用的影响 也就是 氢键和溶剂效应 N R和 e是长程或非局部贡献 是屏蔽常数中的次要部分 这些作用对所有的核都一样 因此 对于轻原子 特别是质子比较重要 而对重原子的影响就很次要了 化学位移 4 屏蔽常数的影响因素 抗磁屏蔽项 对于球对称电荷分布的自由原子 在外磁场B0作用下 所有的电子都绕外磁场旋进 这种旋进诱导产生一个次级磁场B 其方向与B0相反 起着减弱外磁场的作用 即加强屏蔽作用 顺磁屏蔽项 对于分子来说 核外电子云的分布不是球对称的 电子不能自由地绕外磁场旋进 其旋进受到不同程度的阻碍 另外 由于分子中除了所研究的核 还有其它核的存在 也使阻碍了电子的旋进 意味着屏蔽作用的减弱 这两项都是代表了核所处周围电子云对所观测核的影响 是屏蔽常数的主要成分 但是在大分子中 邻近基团的影响以及分子间的屏蔽贡献也是十分重要的 化学位移 5 化学位移的表达 核磁共振测得的是核的共振频率 根据共振条件 共振频率与磁场强度B0有关 意味着 800MHz谱仪上测出的核的共振频率是400MHz上的一倍 实验结果不具可比性 屏蔽效应导致的同一种核的共振频率的差异很小 使用不便 比如 400MHz中1H的共振频率是400 001234 化学位移是一个相对值 而且是个无量纲的量 化学位移 ppm 定义 TMS DSS 0 化学位移 6 参考物 内标与外标 内标 把溶在同一溶剂中的参考物和样品装入样品管直接进行测试 外标 把参考物放入毛细管中与样品隔开 参考物的条件 信号很强的单峰 峰型尖窄 仅需加入少量样品 屏蔽常数很大 谱线最好和绝大多数化合物谱线没有重叠 化学惰性 磁各向同性 谱线不随浓度 温度等变化有显著的位移 能溶于多种溶剂 溶剂效应小 影响化学位移的因素 取代基电负性 诱导效应 与氢相连碳原子的P S杂化 共轭效应 相邻键的磁各向异性效应 环电流 双键和羰基 炔基 范德华效应 氢键效应 介质的影响 化学位移 7 化学位移影响因素 取代基电负性 诱导效应 诱导效应 氢原子核外成键电子的电子云密度产生的屏蔽效应 拉电子基团 去屏蔽效应 化学位移左移 即增大推电子基团 屏蔽效应 化学位移右移 即减小 电负性较大的原子 可减小H原子受到的屏蔽作用 引起H原子向低场移动 向低场移动的程度正比于原子的电负性和该原子与H之间的距离 共轭效应 p 共轭正屏蔽移向高场 共轭去屏蔽移向低场 化学位移 8 化学位移影响因素 相邻键的磁各向异性效应 各向异性效应 在分子中处于某一化学键的不同空间位