《花药和花粉培养》PPT课件.ppt

园艺植物组织培养学 主要参考书 巩振辉 申书兴 植物组织培养 化学工业出版社 2007王蒂 植物组织培养 中国农业出版社 2004李浚明编译 植物组织培养教程 中国农业大学出版社 2002周维燕 植物细胞工程原理与技术 中国农业大学出版社 2001邓秀新 胡春根 园艺植物生物技术 高等教育出版社 2005 一 概况 1 概念花药 anther 花的雄性器官 包括二倍体的药壁和药隔组织和单倍体的花粉粒 pollengrain 一 概况 花药和花粉培养 指将花粉或花药作为外植体 接种在合成培养基上 改变花粉的发育途径 使其不形成配子 而像体细胞一样进行分裂 分化 最终发育成花粉植株 单倍体 的技术 花粉培养与花药培养异同点 区别花药培养属于器官培养范畴 花粉培养属于细胞培养范畴 共同点在培养过程中都是花粉发育 均可获得单倍体细胞系或单倍体植株 2 发展概况 1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体 并证明胚状体直接起源于花粉粒 最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本 法国 丹麦 德国等相继开展花培研究工作 目前已有10个科 24个属 34个种 250多种高等植物的花药培养获得成功 花粉培养始于50年代 Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织 随后人们进行了很多研究 在许多植物上进行花粉培养 同时随着培养技术的逐步完善 看护培养 条件培养 获得愈伤组织 胚状体 有的还获得单倍体植株 我国花培发展概况 始于70年代 将花培与传统育种手段相结合 先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种 如烟草 小麦 玉米 甜椒等花培新品系 品种1974年 中科院植物所与山东烟草研究所合作 成功育成烟草新品种 并大面积推广 这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种 我国花培发展概况 国际公认 我国的花培工作处于国际领先水平 我国有30多种植物进行花培试验 20多种获得了花粉植株 有一大部分是我国首创 同时在花培方法 机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers 花药培养起始于印度 而首先却在中国广泛应用 就花药培养的单倍体育种的应用而言 中国在世界上处于领先地位 3 意义 基础理论研究方面研究减数分裂 花粉生长机制的重要方法用来进行生理 生化 遗传等基础理论的研究 花粉粒体积小 数量多 形状 内含物成份基本一致 是比较均一的起始材料 便于在人工控制条件下研究它们的生长 分化 遗传等变化过程 3 意义 遗传育种 单倍体育种中的意义可获得纯合二倍体 大大缩短育种周期具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种 克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选 大大提高突变育种的工作效率 二 培养方法 1 途径 脱分化到再分化 变异率提高 混倍现象明显 取决于培养基中激素的种类 浓度配比 程序简单 不需再分化 一次成苗 技术还没有完全掌握 花粉植株 花药培养与花粉植株的形态发生方式 3 花粉培养 不存在体细胞干扰 没有混倍现象小孢子均匀接触理化诱变因素 是研究吸收 转化和诱变的理想材料可观察到雄核发育的全过程 是很好的遗传和发育研究的体系培养技术难度大 1 花粉培养的优缺点 2 花粉分离与纯化 自然散落法 未开的花 花药 固体培养基 液体培养基 裂开 花粉散落 移走花药花粉培养 花粉散落 过滤离心浓缩 接种培养 消毒灭菌 挤压法 无菌花药 花粉 碎片混合物 花粉滤液 弃上清 花粉沉淀 离心 收集纯净花粉 104 105个 ml 培养 液培养基玻棒挤压研钵研磨 级联过筛 200转 分离心 200转 分 液体培养基 液培养基 挤压法 优点操作简便 缺点花粉中易混有体细胞悬浮液中花粉密度不易控制 注意 液体培养基中加蔗糖或甘露醇 调节渗透压 避免花粉吸水胀裂 机械游离法 无菌花药 花粉 碎片混合物 花粉滤液 弃上清 花粉沉淀 离心 收集纯净花粉 104 105个 ml 培养 液培养基搅拌混合器 级联过筛 200转 分离心 200转 分 液体培养基 液培养基 操作方便 重复性好 可一次处理大量材料 目前广泛用于油菜 玉米 小麦 大麦等禾谷类作物上 培养方式固体培养 3 花粉培养方法 液体培养 花粉浓缩液 含有2倍培养密度的花粉悬浮液 固培40 熔化 等体积 含有单倍培养密度的花粉培养液 薄层用蜡封 细胞团 平板培养 花粉平板培养示意图 平板培养 platecultivationmethod 平板培养 续 植板率 100 Nitsch等 1973 先后将曼陀罗和烟草花粉放在平板上培养 形成了胚 进而分化成单倍体小植株优点 便于对单个细胞标记观察 每个平板上接种的细胞数目 每个平板上形成的细胞团数目 花药 花粉粒 细胞团 固体培养基 润湿的滤纸 Sharp等 1972 培养番茄花粉 形成了细胞无性系 看护培养 nursecultivationmethod 微室悬滴培养法 microchamberculturemethod 花药消毒 花药裂开花粉散落 悬浮液50 80粒 滴 盖玻片 置于凹穴载玻片上 石蜡封片 细胞团 静置一夜 收集悬浮 1滴 翻转 25 转动 Kamega等用此法用甘蓝 芥蓝的F1代成熟花粉培养获得成功优点便于观察缺点培养基太少 水分易蒸发 培养基成分会发生变化 影响花粉细胞进一步发育 条件培养 conditionedmediummethod 在合成的培养基中加入失活的花药提取物 接入花粉进行培养失活花药的提取物中含有促进花粉发育的物质 有利于花粉培养成功目前 此法用的较多 花药 培养基 取出花药 沸水 杀死细胞 研碎 离心 上清液无菌过滤 添加入培养基 培养 花粉植株 1周花粉萌动 液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养置于摇床上震荡 使其处于良好的通气状态 4 花药培养 1 培养方法琼脂固体培养法培养基中加入0 5 0 7 琼脂 呈半固体状态 花药1 3浸入培养基中而不沉没为宜 液体培养法 直接将花药接入呈液体状态的培养基中 注意事项 通气状况 少量加液体培养基成一薄层 使花药浮于液面 与空气接触 加入聚蔗糖 增加比重 使花药不下沉浮于液面上 及时转移沉入底部的长大的愈伤组织 否则会影响再分化培养效果 2 操作步骤 取材 注意时期 预处理 高温 低温 N饥饿等 消毒 无菌接种避免损伤 愈伤1 3mm 胚状体 分化培养基 单倍体植株 三 影响花培成功的因素 有些难培养植物诱导频率很低 有些植物 裸子植物 至今没有获得真正的花培植株 花药培养虽然是一项成功的技术 但要获得良好的效果 还需克服许多困难 诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响 一 供试材料 1 材料的基因型材料的遗传背景不同 诱导难易程度不同茄科番茄 蔓陀罗 烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种 40 80 优于籼米亚种 2 花药培养力是可以遗传的 且为显性或超显性 2 植株的生理状态和年龄 年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天 诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿 高N水稻高温 高N下 诱导率下降 白化苗提高 3 花粉发育时期 四分体时期单核期 早 中 晚期双核期三核期 是影响花培成败的最关键因素之一 被子植物的花粉发育阶段 不同植物最适诱导期不同曼陀罗 烟草属 水稻 单核早期 双核期均可诱导 以单核中 晚期效果最好小麦 玉米 只有单核中期才能诱导大麦 单核晚期最佳一般采用单核中 晚期的花粉培养 处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗 小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期 超过了这一时期胚状体就不能形成 在小孢子发育过程 花药内激素水平正在不断改变 由于花药的成熟使激素平衡变得不适合 或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽 从而影响了诱导率 培养前应确定花粉发育时期镜检 醋酸 洋红 I KI染色 禾本科 茄科 焙花青 烙矾法 木本 番茄 利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养 确定最佳时期 4 材料的预处理 高 低温预处理烟草 7 9 7 14天番茄 6 8 8 12天水稻 10 2 14天小麦 黑麦 1 3 2 20天化学物质 高糖 甘露醇 乙烯 低氮离心 射线 等处理 试验证明 有几种预处理方法能有效提高诱导率 二 培养基 1 基本培养基MS应用最多 N6 B5 Nitsch也有应用不同植物种类 适用的培养基不同双子叶 Nitsch MS十字花科 豆科 B5水稻等禾谷类 N6 2 碳源 蔗糖应用最广 既是最好的碳源 又起调节渗透压的作用不同植物种类 不同诱导时期最适碳源浓度不同 通常以2 5 为宜烟草 2 诱导胚状体小麦 8 10 愈伤 5 8 分化水稻 4 6 愈伤 2 3 分化玉米 12 15 愈伤 3 激素 花粉 愈伤组织 植株 胚状体 植株 脱分化 再分化 关键决定于激素种类 浓度 配比 实例 小麦 2mg L2 4 D愈伤 2mg L胚状体 茄科 高生长素 花粉胚 愈伤组织 愈伤组织 低生长素 低生长素 高生长素 植株 高细胞分裂素 4 其它添加物 有机附加物水解乳蛋白水解酪蛋白酵母提取物肌醇谷氨酰胺等 活性炭 0 5 1 吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5 羟甲基糠醛吸附了激素 降低了激素水平 三 培养方法和培养条件 1 材料的接种保证完全无菌条件注意接种密度104 105粒 ml为好 花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高 养分消耗太快密度太低 诱导率下降 2 培养方法 液体培养基近年来较多采用优点 诱导率显著提高缺点 有些植物进一步分化困难 白化苗率提高利用条件培养基也可大大提高培养效率 3 培养条件 温度 最重要 通常24 28 最适光照 影响分化途径 花粉 愈伤组织 植株 胚状体 暗 光 光 花粉胚 植株从花药囊中长出 茎叶细弱 根系不发达 很难直接移栽 需锻炼壮苗 四 植株的诱导和移栽 愈伤组织 植株愈伤组织的年龄显著影响分化频率 实例 小麦水稻 愈伤组织2 3mm 分化率50 80 分化率8 10 5 8天 20天 转移