PCR的影响因素及解决方法.doc

PCR的主要影响因素及常见问题解决方法第一部分、PCR的主要影响因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只 能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不 同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：9460s, 3760s, 72120s，共2530个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在 自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要3060s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚 、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。 关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适 于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。 1模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启 动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温 度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95。2引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度 低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反 应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -5其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G+C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55 。在典型的引物浓度时（如0.2mol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。 3引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取7075，在72时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1 kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步， 而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效 的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min，与此同时， 在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。4循环次数常规PCR一般为2540个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数 太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。 扩增结束后，样品冷却并置4保存。二、引物引物设计要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距 离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的 关键，引物设计也就更为重要。引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为1520个碱基 ，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括： 1引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少 于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72）下不 会形成稳定的杂合体。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引 物5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2（G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段 （G+C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%60%为佳。 3引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。例如： 4引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“ 引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的 双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引 物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少， 非特异扩增增加。5引物3端配对DNA聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所以，引物3端56个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格 ，这样才能保证PCR有效扩增。引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液 中4保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存12 年。三、DNA聚合酶早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶纯品。DNA聚合酶是由 分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并 有35外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有53外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作 用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有35外切酶活力，能识别和消除错配的引物 末端，与复制过程中校正功能有关。三是53外切酶活力，它能从5端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核 苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法，以Klenow片段完成-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow 片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60（B.Stearothermophilus）到87（ S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于P CR。现就PCR反应中常用的DNA聚合酶等作一详细介绍。1Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95的双链D NA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物 和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：Klenow酶的最适温度为 37，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为7475。因而使退 火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow 酶为20个（均用1g基因组DNA开始）而Taq酶为30个。延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为40 0bp以内。Taq酶由水栖高温菌（Thermus aquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生 长温度为7075。最初从中分离到分子量6068KDa，比活性为20008000U/mg的DNA聚合酶。后来Cet us公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为7580，与单纯 核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子。以M 13 模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70时Kact60nt/s；55可达24nt/s；37时为1.5nt /s，而22时低至0.25nt/s。高于90时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。 在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5,95及97.5保持其50%活力的时间分别为130、40及56min，在 50次循环的PCR中当管内最高温度为95。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq 酶在95的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95。Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠 杆菌DNA聚合酶有38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。 Taq酶具有依赖DNA合成的53外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会 阻止来自上游引物链的延伸，而对于5-32 P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3 5外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太 有利。一般错掺率为1.2510-4110-5(4dNTPs浓度分别为200mol/L，Mg2+ 为1.5mmol/L，在55退火)。但不含35外切酶活性对测序有利。2影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.70.8mmol/L,Mg2+为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/L MgCl2抑制活力达40%50%。dNTP能与Mg2+结合，故游离Mg2+只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至46mmol/L时,Taq酶活力要降低2030%，即底物抑制。dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100lPCR液中含dNTP各 40mol/L时就足以合成2.6g的DNA（dNTP消耗一半）。 表22-3 有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响物质浓度活力（%）乙醇3%10010%110尿素0.5mol/L1001.0mol/L1181.5mol/L107DMSO1%10010%5320%11二甲基甲酰胺5%10010%8220%17甲酰胺10%10015%8620%39SDS0.001%1050.01%100.1%20 0mmol/L的KCl可使酶失活。加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可产生中度抑制或无作用。低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用。3第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将Taq DNA聚合酶的53外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5的半衰期从Taq DNA聚合酶的56min提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR（Multiplex PCR）更为有利。VentTM DNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100高温且2h以上仍有活力，并且具有35外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Ta q酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在104生长的Pyococcus菌GB-D株植入Dee p Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95的半寿期达23h（Vent酶为6.7h,Taq酶为1h）。4RTth逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录-PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也 有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Transcriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，二种活性分 别依赖于Mn2+Mg2+ ，这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA即可有效地进行RT-PCR，得到特异的DNA片段，从而非常有利 于逆转录PCR的发展。耐热DNA聚合酶的研究近几年来得到长足的发展，这在PCR发展中起到了重要的作用。我们相信随着进一步的研究，将使人们对耐热 DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。我国的PCR研究发展很快，其关键试剂-耐热DNA聚合酶-也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、 中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4 DNA聚合酶，其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶，为我国PCR的开展提供了保证。四、影响PCR特异性的因素通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：退火步骤的严格性：提高退火温度可 以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降 低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。改变MgCl 2 (有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。模板中如果存在次级结构，例如待扩增的 片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸（7-deaza -2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de 7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150mol/L de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/L dGTP，则可阻非特异性产物的生成。五、扩增平坡扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取 决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.31pmol时，由于产物 的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能 ：1底物过剩因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100l反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1g（ 3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。 但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。2非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提 高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。3退火时产物的单链自己缔合两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物 浓度到达10pmol/100l时即可发生此现象，除稀释外无法克服。 4变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取 得优良的特异性和产率。第二部分、PCR常见问题总汇PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4过夜。B）插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，