几种显微技术的应用.ppt

第八章几种显微技术的应用明视场研究用显微镜的操作技术镜检顺序1 打开主电源开关 在打开之前 应先将右侧电压升降拉杆放在最低处 再打开主机开关 并逐步升高电压 底座上发光二极管可显示当前电压值 2 把标本固定在载物台上3 用10X物镜对焦 将10X物镜引入光路 先粗调 再微调达到最清晰 4 双目镜筒间距和视度差的调节5 根据要求放大倍数 旋转物镜转换器 使所选物镜进入光程 再进行微调 使标本清晰 光亮不足 可增大电压或取掉ND滤光片 聚光镜的调节聚光镜位置调节 缩小视场光阑 视场中出现一个正多边形 若边缘不清楚 表明聚光镜的位置不合适 慢慢向上或向下调整聚光镜 使多边形边缘逐渐达最清楚 这样聚光镜就处于正确位置 视场光阑处于最大状态 缩小视场光阑 聚光镜中心位置调节 将视场光阑缩至较小状态 旋转两个聚光镜中心调节螺丝 把正多边形的视场光阑像移到目镜中心 慢慢开启视场光阑 直至目镜视场与正多边形的视场光阑像外切 中心调节螺丝 视场光阑的调节调节照明范围 按物镜情况缩小视场光阑 遮断多余的光线 从而获得分辨率和反差好的像 且增大焦深 标本反差低时 在摄影时以视场光阑像占目镜视场以70 80 为宜 视场光阑像 目镜视场 孔径光阑的调节通过物镜的数值孔径与照明系的数值孔径相对应 可得到分辨力和反差好的像 并可增大焦深 显微标本一般反差较低 调节时可使孔径光阑像占物镜光瞳的70 80 较合适 物镜光瞳 孔径光阑像 浸油物镜的使用 先用低倍物镜对焦 在标本上滴上浸渍油 旋转转换器 把浸油物镜引入光程 用微调旋钮对焦 浸油聚光镜的使用先把标本从镜台上取出 把油滴在聚光镜的前透镜上 再把标本放到载物台上 慢慢升高聚光镜 直到与载玻片接合为宜 使用完后用无水乙醇与乙醚 3 7 混合液擦去浸油 观察中滤色片的使用 1 防止耀眼和减轻眼睛疲劳 防止耀眼 采用乳白色玻璃或毛玻璃滤光 也可用滤光镜 减轻眼睛疲劳 根据标本颜色选用绿色 黄色或兰色滤光片 把刺激眼睛的红光吸收掉 以减轻眼睛疲劳 2 增进分辨力 将白光中波长较长的光波吸收掉 利用短波光照射 如绿色或兰绿 各类滤色镜 3 增大反差 选用与标本颜色互补的滤光片 荧光显微镜的原理及操作技术荧光的产生被检物体接受一定波长的激发光 吸收能量变成高能态 立即放出能量 发出长波光 发出的长波光称为荧光 一次荧光 固有荧光或自发荧光 一些物体经过短波 紫外线 照射后 本身就能产生荧光 第二次荧光很多被检物必须事先用荧光物质进行处理 再经紫外线等短波光照射 才能产生荧光 落射式荧光显微镜 落射式荧光显微镜原理 分色镜的作用分色镜放在镜筒中间与入射光线成45 使入射光线反射并发生方向变化 照向被检物体 它具有使短波光反射 长波光透过的作用 激发滤色镜作用装在激发光的光路中 阻止长波光的透过而使短波光通过 吸收滤色镜的作用安装在观察长波光光路中 吸收短波光 让长波光透过 荧光显微镜的特点光源光源是短波光 一般采用100W或200W的超高压汞灯 激发出的光谱是紫外 紫兰及部分强可见光 所以所有的标本均可用高压汞灯进行激发 通过激发滤光片 得到不同的激发效果 使用超高压汞灯注意事项 由于超高压汞灯激发产生紫外线等短波 伴随会产生大量的热量 所以应具有隔热设备 但并不阻碍紫外线的通过 工作环境不能太热 否则影响灯泡的使用寿命及其它附件的工作性能 紫外线对人体有损害作用 必须具有遮光板 棕红色 并且不能用眼睛在旁边观看 更不能在灯泡未装入灯室而在外边进行启动 这样易爆炸 200W超高压汞灯 在每次开启超过两个小时的情况下 平均寿命400小时 100W在相同条件下 平均使用寿命200小时 若刚启动20分钟到1小时之内关电源 会使使用寿命减半 坚决不能在15分钟之内切断电源 滤色镜类激发滤光片 紫外光激发滤光片可使400nm以下的紫外光透过 而阻挡400nm以上的光 紫兰光激发滤光片可使350 490nm范围的光透过 而阻挡其它范围波长的光 紫外紫光激发滤光片可使300 450nm范围波长光通过 吸收滤光镜根据激发镜的不同而确定 原则以完全吸收阻碍激发光 短波光 为宗旨 分为三类 紫外光吸收滤光片 紫兰光吸收滤光片 紫外紫光吸收滤光片 物镜由氟石磨制的半复消色差物镜 物镜上标有FL标记 40 物镜一般就需要加油观察 油必须是无荧光油 落射式荧光显微镜物镜内设置聚光镜 在高倍时带有虹彩光阑 可以调节焦深 在标本荧光较弱时 尽量使用N A 大的物镜 落射式荧光显微镜的使用方法准备工作1 灯泡的安装a 旋开灯室固定灯泡装置的螺丝 取出灯座 b 按照要求正负极安装高压汞灯 同时注意灯泡抽真空咀痕迹不能正对光路 而应错开 最好垂直方向 2 接通电源 打开电源开关 与此同时 电源指示绿灯点亮 a 打开电源开关时 有时灯不立即点燃 这是由于电极老化的原因 可进行几次重复打开电源 若灯寿命已尽请更换新灯泡 b 点燃2 3分钟后 光线将稳定 c 点燃15分钟内不能切断电源 d 每次关掉电源开关 重新启动间隙不得少于3分钟 每次更换灯泡以后 请把计时器放在 0 位 3 灯位调中a 打通光路将光路中挡光板放在光完全通过的位置 b 视场光阑 F 和孔径光阑 A 旋到最大位置 c 将物镜旋出光路 并从物镜转换器上拆一个防尘帽盖 装上定心屏 就在定心屏上出现弧形图角或其它图像 d 用调焦柄 在灯室前 对弧形进行调节 使其达最清楚 e 通过灯泡调中螺丝对弧形调中 定心屏 视场光阑 F 孔径光阑 A 调焦柄 荧光观察 1 将标本的观察范围放在视野内 进行调焦 2 根据要求选择分色镜类型 并使激发滤光片和吸收滤光片同时进入光路 3 缩小视场光阑 F 使多边形出现在视场内 如果多边形不在视场中心 请用调节视场中心钮调中 4 变化孔径光阑 A 使观察视场出现最理想的像 荧光显微镜标本制作要求载玻片载玻片厚度应在0 8 1 2mm之间 太厚的坡片 一方面光吸收多 另一方面不能使激发光在标本上聚集 盖玻片盖玻片厚度在0 17mm左右 光洁 为了加强激发光 也可用干涉盖玻片 即表面镀有氟化镁的盖玻片 它可以使荧光顺利通过 而反射激发光 这种反射的激发光又可激发标本 标本组织切片或其他标本不能太厚 如太厚激发光大部分消耗在标本下部 而物镜直接观察到的上部不充分激发 另外 细胞重迭或杂质掩盖 影响判断 封片剂封片剂常用甘油 必须无自发荧光 无色透明 荧光的亮度在pH8 5 9 5时较亮 不易很快褪去 所以 常用甘油和0 5mol LpH9 0 9 5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封片剂 镜油最好使用特制的无荧光镜油 使用荧光显微镜的注意事项1 严格按照荧光显微镜要求进行操作 不要随意改变程序 2 点燃超高压汞灯5 15min 待光源发出强光稳定后 再开始观察标本 最好在暗室中进行 3 在调整光源时应戴上防护眼镜 防止紫外线对眼睛的损害 4 检查时间每次以1 2h为宜 超过90min 超高压汞灯发光强度逐渐下降 另外 标本受紫外线照射3 5min后 荧光也明显减弱 5 荧光显微镜光源寿命有限 标本应集中检查 以节省时间 保护光源 6 标本染色后立即观察 因时间久了荧光会逐渐减弱 体视显微镜的原理及操作技术用途 主要用于实体解剖 观察 特点 1 像是正立的 2 有两个物镜 其夹角为12 15 使标本具立体效果 3 工作距离长 4 焦深大 放大倍数较小 最大放大倍数为240倍 5 物镜镜口率小 分辩率低 6 照明方式有两种 一种是用侧光源从一侧或两侧斜照射 另一种是透射式照明 透射式照明有明暗视野之分 7 主体上具有连续放大旋钮 操作程序观察1 打开电源开关 向前推动提高电压 2 转换观察光路 即明视场和暗视场转换 3 将标本放于载物台上 光线若太暗或不均匀 可在旁边用侧光照明 4 进行瞳距调节 5 进行左右眼曲光度校正 6 将连续变倍旋钮放在最低倍 7 调焦 观察 8 增大连续变倍的倍数 重新调节焦距 9 调节孔径光阑的大小 使像达到最清晰 10 进行标本观察与解剖 倒置生物显微镜的使用XDS系列倒置生物显微镜特点和用途特点具有长工作距离的平场消色差物镜 长工作距离的聚光镜 具有相衬装置 用途适合于附着在培养皿底或悬浮在培养基中的活体观察 是细胞培养 组织培养及微生物研究的必备仪器 视场光阑 滤光片 孔径光阑 调中旋钮 摄影拉杆 环板插孔 操作技术1 将亮度调至最小 打开开关 再将亮度调至适中 2 将标本置于载物台上 将低倍物镜置入光路 通过目镜观察 使用粗 微调焦手轮使标本成像清晰 3 调整双目瞳距与观察者瞳距一致 4 聚光镜位置和中心调节 5 孔径光阑调节 6 调整并列的三个灯源调节手柄 使灯丝成像于孔径光阑正中 可临时放一白色纸片在聚光镜保护玻璃上观察 7 滤色片选择8 将高倍物镜置入光路 用右目镜观察 调整微动手轮使成