《染色体与DNA终板》PPT课件.ppt

SouthwestUniversity 第二章染色体与DNA 二 一一年九月 娜日q657071944 细菌基因组 真核DNA与基因组 蛋白质 略 染色体 类核 蛋白质 未知 单一序列为主 单一序列 重复序列 短片段重复 长片段重复 核小体 基本单位 一级结构 核丝 高级结构 螺旋管 侧环 基因组与染色体章节知识网络 原核 真核 基因组 一个细胞中遗传物质的总量 原核 一套染色体遗传物质的总量 真核 遗传物质所携带的信息 人类基因组测多少条染色体 C值 在每一种生物中其单倍体基因组的DNA总量 遗传物质的化学含量 DNA与基因组概念 爪蟾的基因组大小与人类相同 C值 C值悖论 C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象 C值的不统一反应了基因组大小与遗传复杂性间缺乏必然的联系 一些门类中 生物复杂性差不多 但DNA含量相差甚大 基因组大小差异 昆虫 两栖类 植物里非常突出 鸟类 爬行 哺乳却没有这种现象 DNA与基因组概念 蟋蟀基因组大小为果蝇的11倍 而组成这些昆虫动物的基因数目不可能有这么大的变化 除了基因 基因组里含有哪些序列导致差距 DNA与基因组概念 原核基因组含有大量的单一序列 仅有少量的重复序列 真核基因组含有少量的单一序列和大量的重复序列 真核生物DNA序列大致被分为3类 不重复序列 中度重复序列 高度重复序列原核生物的细胞中除了主染色体DNA以外 还含有质粒DNA和转座因子 真核生物除了染色体DNA以外 还存在细胞器DNA 线粒体基因组 DNA与基因组概念 细菌虽然没真核细胞核染色体那样的结构 但是它们的基因组以类核的形式存在 并不裸露 细菌的基因组是一个类核 细胞中致密物质就是类核 菌体破碎后 类核以环状纤维的形式释放 类核有约100个独立的负超螺旋结构域 每一个环长约40kb 13微米 每200bp就有一个负超螺旋 即基因组中含5 的负超螺旋 支架 保持了独立性 细菌的基因组是超螺旋的 大肠杆菌 2 4 109Da 4639kb 闭合环状DNA 约编码4288个基因 莲人在绿杨津 玉淑声歌新阙 一 采 采莲人在绿杨津 在绿杨津一阙新一阙新歌声淑玉 歌声淑玉采莲人28字 14字 叠字联 1977年 Sanger在 Nature 上发表噬菌体 174的全部核苷酸序列 基因组含有5386nt 11个基因 3个转录单位 由3个启动子 pA pB pD 启动 5386nt最多能编码1795个氨基酸 若每一个氨基酸的平均分子量为110Da 则总的蛋白质分子量为197 000Da 但实际却为262 000Da 将全部的DNA顺序与蛋白质的氨基酸顺序进行比较 发现了重叠基因 噬菌体的基因组 噬菌体的基因组 重叠基因 overlappinggene 是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列 或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分 基因的重叠是为了节约碱基 能经济和有效地利用DNA遗传信息量 更重要的可能是参与对基因的调控 真核生物的基因组分子量很大 形态为线状 约编码100万个以上的基因 染色体和组蛋白结合形成四级结构 人类的每个细胞在单倍体的核中DNA长约30亿个碱基对 估计编码2 2 5万个基因 每条染色体含碱基8千万至3亿不等 现已有5千个基因被编目 1900个基因已进行了染色体定位 600个已被克隆分离出来 若将一个细胞中每条染色体的DNA首尾彼此相接 全长约200cm 真核生物基因组 人类基因组3 109bp 基因和基因相关序列 20 30 基因以外非编码序列 70 80 非编码序列 90 编码序列 多数为单一序列 10 中度 高度重复序列 20 30 单一序列 轻度重复序列 70 80 分散的重复序列 40 成簇的重复序列 60 短分散序列 Alu 长分散序列 小卫星 微卫星 真核生物基因组 单一序列 亦称非重复序列 是指在基因组中只有1个拷贝或2 3个拷贝的序列 真核基因组中大多数基因是单拷贝的 但单拷贝序列在真核生物中大部分不编码 编码的序列仅占百分之几 注意 真核生物基因组 单一序列 真核生物基因组 重复序列 正向重复 这种重复序列的方向是相同的 如转座子的两端的宿主序列以及端粒结构等 反向重复 呈两侧对称 镜像关系 常存在于插入序列和转座子两端的结构元件中 回文序列 是一种旋转对称 回文序列常存在于各种蛋白质结合位点 特点是在该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同 注意 并非在同一条链上正读反读 重复序列 短片段的重复序列按排列方式不同可分为三种类型 反向重复与回文序列 回文序列变性后再复性时 同一条链内的互补的拷贝可以形成链内碱基配对 形成发夹式或 字形结构 真核生物基因组 重复序列 反向重复与回文序列 画上荷花和尚画 书临汉字韩林书 顺反相同 轻度重复 中度重复和高度重复序列 轻度重复 在基因组中有2 10个拷贝 常常是编码的序列 如 酵母的tRNA基因 人 小鼠珠蛋白基因 血红蛋白 中度重复 基因组中有10 几千个拷贝 长度为300bp 如 rRNA tRNA Alu序列等 重复序列 长片段的重复序列分为轻度重复 中度重复和高度重复三种 rRNA基因集中成簇存在 各重复单位中的rRNA基因都相同 这样的区域称为rDNA 如染色体的核仁组织区 即为rDNA区 间隔区类似卫星DNA的串联重复顺序 由于间隔区中的串联重复次数不同 因此 不同间隔区的长短差异很大 重复序列 中度重复 重复序列 高度重复序列 卫星DNA 高度重复序列 是一种简单的重复序列 富含A T G C含量远比基因组中其它部分要低得多 当将DNA切成片段进行氯化铯密度梯度超离心时 由于富含A T片段的浮力密度小 在离心管中常常单独形成一条较窄的带 在主体DNA带的上面 故称为卫星DNA satelliteDNA 小卫星DNA 重复序列单位在10 100bp之间的序列 微卫星DNA 重复序列单位长度小于10bp的序列 卫星DNA在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同 卫星DNA按其重复序列单位大小可分为 重复序列 高度重复序列 由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同 所以人们就称其为DNA指纹 DNAfingerprints 来自犯罪现场的血迹指纹和7个嫌疑人的血液指纹 AlecJefferys1985年英国遗传学家杰费里斯发现DNA指纹 即子代个体中有50 的条带来自特定的亲本一方 亲子鉴定 染色体结构 核小体 由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构 大量实验证明了这一结构模型 1956年 为双螺旋模型提供X衍射证据的Wilkins和VittorioLuzzati 对染色质进行了X衍射研究 发现染色质中具有间隔为100埃的重复性结构 1971年 Clark和Felsenfeld 首先用葡萄球菌核酸酶作用染色质 发现有一些区域对核酸酶敏感 有一些则不敏感 不敏感的区域比较均一 这暗示染色体中存在着某些亚单位 染色体结构 核小体 1973年 Hewish和Burgoyun 用内源核酸酶消化细胞核 再从核中分离出DNA 结果发现一系列DNA片段 它们相当于长约200bp的一种基本单位的多聚体 表明组蛋白结合在DNA 以一种有规律的方式分布 1974年 M Noll 用外源核酸酶处理染色质 然后进行电泳 证实了以上结果 他测得前三个片段的长度分别为205 405 605bp长 每个片段相差200bp 即染色质可能以200bp为一个单位 染色体结构 核小体 1974年 Kornberg和Thomas 用核酸酶消化一下染色质 用电镜观察发现 单体为一个100埃的小体 二聚体是两个相联的小体 三聚体和四聚体分别由三个小体和四个小体组成 表明 200bp的电泳片段长度级差正好是电镜观察到的一个 绳珠 单位 他们称其为核小体或核粒 提出了染色质结构的 绳珠 模型 染色体结构 核小体 Olins夫妇 1974年 和PierreChambon等 1975 在电镜下观察到大鼠胸腺和鸡肝染色质的 绳珠 状结构 小球的直径为100埃 Olins并把这种小球称为n小体 译成钮体 X衍射图表明 并无可容纳像DNA分子那样大小的孔洞 只可能是DNA缠绕在 珠 的表面 染色体结构 核小体 现已证明 核小体是由H2A H2B H3及H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的 八聚体在中间 DNA分子盘绕在外 HI在核小体的外面 每个核小体只有一个HI 染色体结构 核小体 核小体 200bp 染色质小体 166bp DNA链接区 两个核小体之间的DNA街头区32 34bp 八聚体 DNA 166bp H1 2 H32 H42 2 H2A H2B 146bp 20bp 核心颗粒 核小体核心颗粒模型 核小体核心颗粒结构 核小体可分为核心颗粒和接头区两部分 核心颗粒包括八聚体 H1及结合的146bpDNA 形成1 75圈 每圈80bp 染色体结构 核小体 相邻核小体彼此紧密相联使染色质形成直径为10nm的核丝 nucleofilament 染色体一级结构 核丝 染色体的高级结构 螺旋管 那么核丝怎样形成更高级的结构呢 公认的是螺旋管 solenoid 模型 因为这一模型符合很多作者所观察到的30nm的染色体丝 30nm染色体螺旋丝的照片 这一模型是1976年Finch和Klug提出的 发现在镁离子存时10nm的核丝进一步螺旋化 形成直径为30 50nm的核丝 因而提出10nm的染色质纤丝螺旋缠绕成直径为30nm的螺旋管 H1起到了重要的作用 因为H1用完时仍能形成10nm的染色质丝 却不能形成30nm的纤丝 染色体高级结构 螺旋管 螺旋管的形成 由10nm染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝 称为螺旋管 solenoid 每一螺旋包含6个核小体 染色体的高级结构 螺旋管 侧环模型 30nm纤维成环状以蛋白质核心骨架 scaffold 为中心盘绕形成一个细长 中空的超螺旋圆筒 直径为700nm 从核小体到染色体视频 侧环模型 染色体的高级结构 侧环 由螺旋管怎么形成染色体单体 现在公认模型为侧环模型 认为30nm的纤丝和非组蛋白骨架结合形成很多侧环 人类染色体约2000个环区 每个环和染色体的复制单位 以及表达调控有关 带有侧环的非组蛋白骨架进一步的形成直径为700nm的螺旋 这就是染色单体 原核生物的复制特点 复制起点 方向 速度 复制机制 半保留复制 线性DNA 复制酶系统 双链 型 单链 滚环 DNA复制的知识网 复制的几种主要方式 环状DNA 线粒体 D 环复制 复制起始 大肠杆菌oriC复制原点 复制过程 冈崎段与半不连续复制 复制的终止 真核生物的复制特点 DNA复制可能的三种机制 DNA复制时 先碱基间的氢键断裂 双螺旋解旋 每条链分别作为模板合成新链 产生互补的两条链 新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样 DNA的半保留复制机制 因此 每个子代分子的一条链来自亲代DNA 另一条链则是新合成的 所以这种复制方式称为DNA的半保留复制 Watson和Crick 在1953年4月25日的Nature上的具有划时代意义的题为 MolecularstructureofNucleicAcids 论文的最后一段这样写道 特定的碱基配对性质让我们立刻注意到遗传物质可能的复制机制 双螺旋的本身意味着每一条链可以分离开来 作为新链的模板 于是DNA的量加倍了 而且保证了遗传物质以原封不动的序列形式存在 在文中 他们虽然并没有提及DNA复制的具体机制 但已经就DNA复制的可能采取的是一种半保留方式做了大胆的预测 DNA的半保留复制机制 由Meselson和Stahl设计的被誉为生物学最美丽的实验 themostbeautifulexperimentinbiology 最终证明Watson和Crick预测的正确性 1954年的夏天 Meselson 化学家 CaliforniaInstituteofTechnology 鮑林LinusPauling做研究 去WoodsHole 马里兰州 海洋生物实验室协助Watson进行一些滴定实验 以获得RNA双螺旋结构的证据 巧合的是 来自Rochester大学的FrankStahl博士也在WoodsHole修生理学课程 一天正当Stahl在树下思考噬菌体遗传性的一个问题的时候 他们相遇了 并从此成为了朋友和学术伙伴 1958年 Meselson和Stahl研究了经15N标记3个世代的大肠杆菌DNA 首先证明了DNA的半保留复制 DNA的半保留复制机制 Meselson 左 与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一棵树下重逢时的合影 树下的相遇 a 密度梯度离心的DNA带 b 对应于左侧DNA带的解释 DNA的半保留复制机制 Meselson stahl实验 首先在15NH4Cl培养基中培养 然后转到14NH4Cl培养基中培养 只在15NH4Cl中培养 只在14NH4Cl中培养 14N对照系统 15N对照系统 第一代 第二代 提取DNA 进行密度梯度超离心 复制的起点 方向和速度 复制叉 replicationfork 复制时 双链DNA要解开成两股链分别进行 这个复制起点呈现叉子的形式 复制泡replicationbubble 复制区域像泡状结构 红表 ElectronmicroscopyofreplicatingDNArevealsreplicatingbubbles 复制的起点 方向和速度 复制子 relicon 是指一个复制起点控制下合成的一段DNA序列 原核生物只有一个复制子 也可以说复制起点到复制终点之间的一段DNA序列 也称为复制单位 replicationunit 部分生物复制子的比较 细菌 病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的 真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行复制 也就是说它们的基因组包含有多个复制子 复制的起点 方向和速度 复制的方向 3H dT培养基 自显影图谱上银颗粒的密度 1963年 著名的Cairn实验证明了DNA的复制是双向的 总结 对一个生物体基因组而言 复制起始点是固定的 表现为固定的序列 并识别参与复制起始的特殊蛋白 复制叉移动的方向和速度虽是多样的 但是以双向等速方式为主 枯草杆菌 虽有固定起始点 双向 但不是对称的 质粒R6K 早起为单向复制 复制了1 5基因组后进行双向复制 质粒ColE1 有固定起始点 但却为单向复制 原核生物也并不都是定点 双向对称的模式 也有例外 复制的起点 方向和速度 E coli的基因组是环状DNA E coli有一复制起始点 oriC 全长245bp E coli的复制是双向等速 双链的解旋和复制是同时进行的 复制的主要方式 环状双链DNA的 型复制 在E coli中的单链环状噬菌体有 174 M13 G4等 174为例 它是在单链复制系统中最为复杂 也是研究最为透彻的噬菌体 复制的主要方式 环状单链DNA滚环型复制 1 以亲本链 为模板合成互补的环状负链 形成闭合环状的复制型RF 此过程非常复杂 2 以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环 复制的主要方式 环状单链DNA滚环型复制 1 以亲本链 为模板合成互补的环状负链 形成闭合环状的复制类形RF1 此过程非常复杂 2 以成环滚环复制产生多个子代双链RF 3 以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环 单链环状DNA的复制一般经历3个阶段 以 174为例 复制的主要方式 环状单链DNA滚环型复制 174第一阶段复制形成RF1 复制的主要方式 环状单链DNA滚环型复制 1 型复制是全程起始 而滚环复制是供价延伸 先是在一条亲代链 上切一切口 以负 链为模板 在切开的3 OH上延伸 2 模板链和新合成的链分开 型复制是半保留的新合成的 一条单链总是和模板链互补地结合在一起形成一条子链 而滚环复制3 端不断沿着模板合成 5 端脱离负链 和环形模板完全分开 滚环复制和 型复制是不同的 复制的主要方式 环状单链DNA滚环型复制 3 不需RNA引物 在3 OH上的延伸 4 只有一个复制叉 型复制都有两个复制叉 5 形成多聚体 5 游离的部分经半保留复制形成双链 含有多个基因组 串联在一起形成多联体 复制的主要方式 真核生物线粒体D 环复制 环状双链DNA在特定位点启动复制 开始时H链为模板合成新链 合成只前进了一小段距离 它取代了原来互补的L链 而这条链仍是单链 根据这个区域的特性将它命名为替代环或D环 D 环复制中 互补链上的复制起始点位于不同的位点 D 环复制是单向复制的特殊方式 哺乳动物线粒体DNA维持一个开放形式 每条链的复制有一个独立的复制起始点 真核生物线粒体复制从D 环开始 就复制而言 线性DNA的两端是个问题 线性复制子末端合成DNA 上面这条亲链的末端上合成互补链 则必须从最后一个碱基开始合成 否则这条链会在连续的复制周期中变得越来越短 线性末端启动子的例子 腺病毒和 29噬菌体的DNA 这些DNA在两个末端启动复制 机制是链取代机制 stranddisplacement 被替换的链独立地复制 此时需要在分子末端通过一些短互补序列之间的碱基配对而形成双链体起始点 末端蛋白有双重作用 携带一个胞嘧啶核苷酸提供引物 与DNA聚合酶结合 聚合酶和末端蛋白复合物带有引物胞嘧啶核苷酸 与腺病毒DNA末端结合 胞嘧啶核苷酸游离的3 OH引发DNA聚合酶的延长反应 1956年 A Kornberg和他的同事们发现了DNA聚合酶 DNApol 称为Kornberg酶 后来相继发现了DNApol 和DNApol 并发现DNApol 才是DNA复制的主角 原核生物DNA的复制特点 酶系统 DNA聚合酶 右图 阿瑟 科恩伯格 右 于1959年获颁诺贝尔奬情况 左图 59岁罗杰 科恩伯格 左 获2006年度诺贝尔化学奖 早已夺过诺贝尔奖的父亲阿瑟 科恩伯格 右 恭贺 许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂缝 类似于人的右手形 原核生物DNA的复制 酶系统 DNA聚合酶 DNA穿过 手掌 位于由 手指 和 拇指 所形成的沟里 手掌 具有高度保守性 催化活性位点 合成功能 手指 将模板正确地结合到活性位点上 固定作用 拇指 使DNA的前进提供能量 DNA聚合酶结构包括催化位点的手掌结构域 使模板DNA定位的手指结构域 和DNA结合并在前进能力中起重要作用的拇指结构域 还有自身活性位点的核酸外切酶结构域和N端结构域 酶系统 DNA聚合酶 的结构 模板的结合位点引物的结合位点引物3 OH结合位点底物dNTP的结合位点5 3 外切酶活性位点3 5 外切酶活性位点 催化活性位点 核酸酶切位点 DNA聚合酶 由6个功能域组成 酶系统 DNA聚合酶 的结构与组装 全酶在DNA上的装配分为三个阶段 一个 二聚体加上一个 复合体 识别引物和模板 形成前起始复合物 b DNA在于 复合体结合的位点构象发生的改变 对核心酶产生很大的亲和 使核心酶与DNA相结合 c tau二聚体结合在核心酶上 形成全酶 DNA聚合酶 全酶的 亚基是由头尾相连的二聚体组成 红 橙色 组成一个围绕DNA双链的完整的环 1 5 3 聚合作用 主要用于DNA的修复和后滞链中RNA引物的置换 2 3 5 外切活性 酶系统 大肠杆菌DNA聚合酶 功能 3 5 3 外切活性 切口平移nicktranslation 基因工程 制备探针 引物的替换 4 内切酶活性 酶系统 大肠杆菌DNA聚合酶 功能 1 具有5 3 聚合作用 但是酶活性很低 只有DNA聚合酶 的5 故也不是复制中的主要酶 2 具有3 5 核酸外切作用 目前认为 DNA聚合酶 的生理功能主要是起修复DNA的作用 酶系统 大肠杆菌DNA聚合酶 功能 1 具有5 3 聚合作用 也有3 5 核酸外切作用 2 它的聚合活性为DNA聚合酶 的15倍 DNA聚合酶 的300倍 是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶 酶系统 大肠杆菌DNA聚合酶 功能 E coli中三种DNA聚合酶的性质比较 单体 链状多肽 单体 复合体 多亚基 yes yes yes yes yes yes yes 切双链 no yes 只切单链 不能切双链 polA polB 多基因 polC 修复 合成短片段DNA 修复 合成 只合成长片段DNA 任何聚合酶尽管它们有能力合成长片段DNA 但却不能将裂缝中相邻的3 OH和5 P连接成磷酸二酯键 只有连接酶 DNAligase 才能做到这一点 Gap 间隙 是由pol 来填补 nick 缺口 是由连接酶连接 原核生物DNA的复制 酶系统 DNA连接酶 四聚体的形式存在 不是酶 是由177aa组成的蛋白质 功能 使DNA受到保护 不被酶降解 也不回复形成双链 原核生物DNA的复制 酶系统 单链接和蛋白 helicase 切断氢键 使双链打开 E coli DnaB 注意写法 六聚体分子 可沿着后滞链模板的5 3 方向并随着复制叉的前进而移动 174噬菌体 rep蛋白 沿着前导链模板的3 5 方向移动 原核生物DNA的复制 酶系统 解旋酶 拓扑异构酶 切断单链 原核生物DNA的复制 酶系统 拓扑异构酶 拓扑异构酶 切断双链 使正超螺旋变为负超螺旋 回旋酶旋转酶拓扑异构酶 酶系统 拓扑异构酶 无论是前导链还是后滞链 都需要一段RNA引物以开始子链DNA的合成 DNA复制时 以DNA序列为模板催化RNA引物合成的酶 称为DNA引发酶 DNAprimase 在E coli里 引发酶 DnaG蛋白 其他一些生物里 RNA聚合酶 酶系统01 02视频 原核生物DNA的复制 酶系统 DNA引发酶 全长245bp 3 13聚体 富含A T 与双链解链有关 4 9bp反向重复序列 作为蛋白的结合位点 大肠杆菌OriC复制原点 结构特点 大肠杆菌OriC复制原点 OriC上前引发所需六种蛋白 大肠杆菌oriC复制起始点处引发的DNA复制过程 约20个DnaA在ATP的作用下与4 9bp保守序列结合 在HU和ATP的作用下 DnaA复制起始复合物使3 13bp序列变形 形成开链 DnaB解旋酶在DnaC的帮助下与单链DNA想结合 进一步揭开双链 与引物结合 起始DNA复制 约20个DnaA在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列结合 在HU和ATP的作用下 DnaA复制起始复合物使3 13bp序列变形 形成开链 DnaB解旋酶在DnaC的帮助下与单链DNA想结合 进一步揭开双链 与引物结合 起始DNA复制 DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链 而不能从头合成DNA链 那么 新DNA的复制是怎么样开始的呢 对于前导链 引发过程比较简单 只要有一段RNA引物 DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去 对于后滞链 引发过程十分复杂 需要多种蛋白和酶的协调作用 还涉及到冈崎片段的形成和连接 复杂的引发体 大肠杆菌OriC复制原点 复制的引发 DNA双链的两条链是反向平行的 复制叉上形成的DNA链一条是5 3 方向 另一条是3 5 方向 两个模板极性不同 DNA合成酶的合成方向为5 3 而不是3 5 方向 这样就无法解释DNA的两条链如何能同时进行复制 冈崎片段与半不连续复制 为了解释这一现象 1968年 日本学者冈崎 ReijiOkazaki 等提出了DNA的冈崎片段 1930 1975 广岛县出生 是日本的分子生物学的先锋 1975年 期待着诺贝尔奖获奖却突然死亡 初中时代在广岛原子弹被炸了的时候被认为是慢性骨髓性白血病突然死去 44岁 冈崎片段与半不连续复制 ReijiOkazaki