07 酶工程制药

生物制药生物制药 7 酶工程制药酶工程制药 酶工程指自然酶制剂在工业上的大规模应用酶工程指自然酶制剂在工业上的大规模应用 1953年年 德国德国 提出提出酶固定化技术酶固定化技术 1969年年 日本日本 用固定化技术拆分用固定化技术拆分DL 氨基酸氨基酸 1971年年 第一届国际酶工程会议提出酶工程的主第一届国际酶工程会议提出酶工程的主 要内容 要内容 酶的生产酶的生产 分离纯化分离纯化 酶的固定化酶的固定化 酶酶 及固定化的反应器及固定化的反应器 酶和固定化酶的应用酶和固定化酶的应用 7 1 概述概述 一一 酶工程简介酶工程简介 Enzyme Engineering 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合酶工程是酶学和工程学相互渗透结合 发发 展而形成的一门新的技术学科展而形成的一门新的技术学科 它是从应用的它是从应用的 目的出发研究酶目的出发研究酶 应用酶的特异催化性能应用酶的特异催化性能 并并 通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术 一 现代酶工程的主要内容一 现代酶工程的主要内容 酶的分离纯化酶的分离纯化 大批量生产及新酶和酶的应用开发 大批量生产及新酶和酶的应用开发 酶和细胞的酶和细胞的固定化固定化及及酶反应器酶反应器的研究的研究 包括酶传感包括酶传感 器器 反应检测 反应检测 酶生产中酶生产中基因工程技术基因工程技术的应用及的应用及遗传修饰酶遗传修饰酶的研究 的研究 酶的分子酶的分子改造改造和化学和化学修饰修饰 结构与功能的研究 结构与功能的研究 有机相中酶反应有机相中酶反应的研究 的研究 酶的酶的抑制剂抑制剂 激活剂激活剂的开发与应用研究 的开发与应用研究 抗体酶抗体酶 核酸酶核酸酶的研究 的研究 模拟酶模拟酶 合成酶合成酶及酶分子的人工设计及酶分子的人工设计 合成研究合成研究 三 酶的来源三 酶的来源 酶的来源酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提 酶的生产目前多数直接从生物体中提 取分离取分离 早期酶的生产多以早期酶的生产多以动植物动植物为主要原料为主要原料 如激肽释如激肽释 放酶放酶 菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 近近1010年来年来 研研 究发展了究发展了动植物组织培养技术动植物组织培养技术 但周期长但周期长 成本成本 高高 工业生产一般都以工业生产一般都以微生物微生物为主要来源为主要来源 微生物种类繁多微生物种类繁多 凡是动植物体内存在的酶凡是动植物体内存在的酶 几几 乎都年从微生物中得到 乎都年从微生物中得到 微生物繁殖快微生物繁殖快 生产周期短生产周期短 培养简便培养简便 并可通并可通 过控制培养条件来提高酶的产量 过控制培养条件来提高酶的产量 微生物具有较强的适应性微生物具有较强的适应性 通过各种遗传变异的通过各种遗传变异的 手段手段 能培育出新的高产菌珠能培育出新的高产菌珠 目前常用的产酶微生物目前常用的产酶微生物 E coli 应用最广泛的产酶菌 应用最广泛的产酶菌 分泌胞内酶分泌胞内酶 经细经细 胞破碎分离得到胞破碎分离得到 工业上用于生产谷氨酸脱羧酶工业上用于生产谷氨酸脱羧酶 天门冬氨酸酶天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶青霉素酰化酶 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 枯草杆菌枯草杆菌 主要用于生产 主要用于生产 淀粉酶淀粉酶 葡萄糖氧化葡萄糖氧化 酶酶 碱性磷酸脂酶碱性磷酸脂酶 啤酒酵母啤酒酵母 用于酿造啤酒 用于酿造啤酒 酒精酒精 饮料饮料 面包等面包等 曲酶曲酶 黑曲酶和黄曲酶黑曲酶和黄曲酶 主要生产糖化酶 主要生产糖化酶 蛋蛋 白酶白酶 淀粉酶淀粉酶 果胶酶果胶酶 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 氨基酰氨基酰 化酶和脂肪酶化酶和脂肪酶 其他产酶菌其他产酶菌 青霉菌 青霉菌 木霉菌木霉菌 根霉菌根霉菌 链霉菌链霉菌 等等 四 酶在医药领域的应用四 酶在医药领域的应用 1 1 疾病诊断疾病诊断 酶学诊断已经发展成为可靠酶学诊断已经发展成为可靠 简便又快捷的诊断简便又快捷的诊断 方法方法 具有广阔的应用前景具有广阔的应用前景 酶学诊断方法包括两个方面 一是根据体内酶学诊断方法包括两个方面 一是根据体内原有原有 酶活力的变化酶活力的变化来诊断某些疾病来诊断某些疾病 二是利用酶来二是利用酶来测测 定体内某些物质的含量定体内某些物质的含量 诊断某些疾病诊断某些疾病 消化类消化类 研究最早 是品种最 研究最早 是品种最 多的一类酶多的一类酶 在这一类酶中主要有胃蛋白酶 在这一类酶中主要有胃蛋白酶 胰酶 淀粉酶 纤维素酶 木胰酶 淀粉酶 纤维素酶 木 瓜酶 凝乳酶 无花果酶 菠瓜酶 凝乳酶 无花果酶 菠 萝酶等 萝酶等 健美生消化酶健美生消化酶 帮助肠胃蠕动帮助肠胃蠕动 2 2 疾病治疗疾病治疗 酶可以作为药物治疗多种疾病酶可以作为药物治疗多种疾病 用于治疗疾病用于治疗疾病 的酶称为的酶称为药用酶药用酶 抗炎净创类抗炎净创类 目前发展最快 目前发展最快 用途最广的一种用途最广的一种 多数是多数是蛋白质水解酶蛋白质水解酶 分解发炎部位纤维蛋白的分解发炎部位纤维蛋白的 凝结物凝结物 消除伤口周围的坏疽消除伤口周围的坏疽 腐肉和碎屑腐肉和碎屑 其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白 使成简单使成简单 的嘌呤和嘧啶的嘌呤和嘧啶 降低脓液的粘性降低脓液的粘性 主要有胰蛋白酶主要有胰蛋白酶 糜蛋白酶糜蛋白酶 双链酶双链酶 淀粉酶淀粉酶 胰脱氧核糖核酸酶等胰脱氧核糖核酸酶等 血凝和解凝类血凝和解凝类 提取自血液 提取自血液 凝血酶凝血酶可使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白可使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白 纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶可溶解血块可溶解血块 治疗血栓静脉炎治疗血栓静脉炎 冠状动脉栓塞等冠状动脉栓塞等 抑肽酶抑肽酶为肽酶抑制剂为肽酶抑制剂 大剂量抑肽酶可明显减少大剂量抑肽酶可明显减少 心脏外科手术后的渗血心脏外科手术后的渗血 解毒类解毒类 用于解除体内存在或因注射某种药物产生 用于解除体内存在或因注射某种药物产生 的有害物质的有害物质 主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶 过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等等 青霉素酶青霉素酶能够分解青霉素分子中的能够分解青霉素分子中的 内酰胺环内酰胺环 使变成青霉噻唑酸使变成青霉噻唑酸 消除因注射青霉素引起的过消除因注射青霉素引起的过 敏反应敏反应 3 3 药物生产药物生产 利用酶的利用酶的催化作用催化作用将前体物质转变为药物将前体物质转变为药物 4 分析检测分析检测 酶法检测或酶法分析酶法检测或酶法分析 如 如 ELISA 免疫组织化学免疫组织化学 Western blot中的中的 HRP 细胞破碎细胞破碎 酶的提取酶的提取 酶的分离方法酶的分离方法 酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略 酶的浓缩酶的浓缩 干燥与结晶干燥与结晶 7 2 酶的分离纯化酶的分离纯化 一 酶的分离纯化技术路线一 酶的分离纯化技术路线 细胞破碎细胞破碎 酶提取酶提取 酶分离纯化酶分离纯化 酶浓缩酶浓缩 酶贮存酶贮存 动物 植物或微生物细胞动物 植物或微生物细胞 发酵液发酵液 离心分离 过滤分离 沉淀分离心分离 过滤分离 沉淀分 离 层析分离 电泳分离 萃离 层析分离 电泳分离 萃 取分离 结晶分离等 取分离 结晶分离等 二 酶的提取二 酶的提取 一 一 细胞破碎细胞破碎 许多酶存在于细胞内 许多酶存在于细胞内 为了提取这些胞内酶 为了提取这些胞内酶 首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破 碎处理 碎处理 1 机械破碎 机械破碎 2 物理破碎 物理破碎 3 化学破碎 化学破碎 4 酶解破碎 酶解破碎 JY92 II D超声波 细胞粉碎机 细 胞 破 碎 珠 高 压 细 胞 破 碎 机 DY89 I型 电动玻璃匀浆机 采用采用缓冲体系缓冲体系 防 防pH大幅度变化而失活大幅度变化而失活 加加保护剂保护剂 防活性基团活性中心受影响 防活性基团活性中心受影响 抑制水解酶抑制水解酶的作用的作用 其他保护措施 温度 其他保护措施 温度 pH 搅拌 光照 氧化等 搅拌 光照 氧化等 影响影响 二 酶的抽提 二 酶的抽提 提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象 盐溶液提取盐溶液提取0 02 0 5M的盐溶的盐溶 液液 用于提取在低浓度盐溶用于提取在低浓度盐溶 液中溶解度较大的酶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取酸溶液提取pH2 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中用于提取在稀酸溶液中 溶解度大 且稳定性较溶解度大 且稳定性较 好的酶好的酶 碱溶液提取碱溶液提取pH8 12的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中用于提取在稀碱溶液中 溶解度大且稳定性较好溶解度大且稳定性较好 的酶的酶 有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机可与水混溶的有机 溶剂溶剂 用于提取那些与脂质结用于提取那些与脂质结 合牢固或含有较多非极合牢固或含有较多非极 性基团的酶性基团的酶 三 沉淀分离三 沉淀分离 沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同 在酶液中添加一定浓度的中性盐在酶液中添加一定浓度的中性盐 使酶或杂质从使酶或杂质从 溶液中析出沉淀溶液中析出沉淀 等电点沉淀法等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低两性电解质在等电点时溶解度最低 不同的两性不同的两性 电解质有不同的等电点电解质有不同的等电点 通过调节溶液的通过调节溶液的pHpH值值 使酶或杂质沉淀析出使酶或杂质沉淀析出 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 法法 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同 添加添加 一定量的某种有机溶剂一定量的某种有机溶剂 使酶或杂质沉淀析出使酶或杂质沉淀析出 复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质在酶液中加入某些物质 使它与酶形成复合物而使它与酶形成复合物而 沉淀下来沉淀下来 选择性变性沉选择性变性沉 淀法淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉 淀淀 而不影响所需的酶而不影响所需的酶 三 酶的纯化三 酶的纯化 过滤与膜分离过滤与膜分离 电泳电泳 离子交换层析离子交换层析 7 3 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化 一一 固定化酶的制备固定化酶的制备 固定化酶固定化酶 immobilized enzyme 指限制或固定于特定空间位置的酶指限制或固定于特定空间位置的酶 即经即经 物理或化学方法处理物理或化学方法处理 使酶变成不易随水流失使酶变成不易随水流失 即运动受到限制即运动受到限制 而又能发挥催化作用的酶制而又能发挥催化作用的酶制 剂剂 2 2 固定化酶的特点 固定化酶的特点 可以多次使用 酶的可以多次使用 酶的稳定性提高稳定性提高 反应后 酶与底物和产物易于分开 产物中无残反应后 酶与底物和产物易于分开 产物中无残 留酶 易于纯化 留酶 易于纯化 反应条件易于控制 可实现转化反应的反应条件易于控制 可实现转化反应的连续化连续化和和 自动控制 自动控制 酶的酶的利用率高利用率高 单位酶催化的底物量增加 用酶 单位酶催化的底物量增加 用酶 量少 量少 比水溶性酶更适合于比水溶性酶更适合于多酶反应多酶反应 二 新型的酶固定化方法 二 新型的酶固定化方法 温和的条件温和的条件下进行下进行 减少酶活力损失减少酶活力损失 提高固定提高固定 化效率化效率 光偶联法光偶联法 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带 光敏性基团的载体共价固定化酶光敏性基团的载体共价固定化酶 等离子体法等离子体法 高度激发的原子 高度激发的原子 分子分子 自由基的自由基的 聚集体聚集体 载体表面用等离子体修饰载体表面用等离子体修饰 引入活性基引入活性基 团团 无载体固定化酶无载体固定化酶直接用交联剂交联直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶用交联剂交联溶解酶 晶体酶晶体酶 物理聚集酶物理聚集酶 和和 喷雾干燥酶等四种无载体酶体系 喷雾干燥酶等四种无载体酶体系 催化活性高催化活性高 成本低成本低 具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面 可加入多种酶可加入多种酶 底物扩散受限制少底物扩散受限制少 极端条件下稳定性高极端条件下稳定性高 三 固定化细胞的方法 三 固定化细胞的方法 固定化细胞固定化细胞 指将细胞限制或定位于特定空间位置的方法指将细胞限制或定位于特定空间位置的方法 第二代固定化酶 第二代固定化酶 不用载体不用载体 通过化学或物理的手段使细胞彼通过化学或物理的手段使细胞彼 此附着相连此附着相连 还有还有载体粘合载体粘合 金属螯合金属螯合等多种方法等多种方法 2 2 固定化细胞的制备技术 固定化细胞的制备技术 载体结合法制备技术 载体结合法制备技术 将细胞悬浮液直接与水不溶性将细胞悬浮液直接与水不溶性 载体相结合载体相结合 载体主要为阴离子交换树脂载体主要为阴离子交换树脂 阴离子阴离子 交换纤维素交换纤维素 聚氯乙烯聚氯乙烯 优点 操作简单优点 操作简单 符合细胞的生理条件符合细胞的生理条件 不影响细不影响细 胞的生长及酶活性胞的生长及酶活性 缺点 吸附容量小结合强度低缺点 吸附容量小结合强度低 包埋法制备技术 包埋法制备技术 与包埋酶法相同与包埋酶法相同 交联法制备技术 交联法制备技术 由于所用交联剂由于所用交联剂戊二醛等对细戊二醛等对细 胞有毒性胞有毒性 一般很少用一般很少用 无载体法制备技术 无载体法制备技术 靠细胞自身的靠细胞自身的絮凝作用絮凝作用制备制备 固定化细胞的技术固定化细胞的技术 通过助凝剂或选择性热变性通过助凝剂或选择性热变性 的方法实现细胞的固定化的方法实现细胞的固定化 还有粘合法还有粘合法 截留法等截留法等 四 常用的固定化酶载体材料 四 常用的固定化酶载体材料 1 1 固定化酶载体材料的性质要求固定化酶载体材料的性质要求 功能基团功能基团 渗透性和比表面 大的比表面和多孔结构渗透性和比表面 大的比表面和多孔结构 溶解性 要求不溶于水溶解性 要求不溶于水 机械刚性和稳定性 机械刚性和稳定性 组成和粒径 孔径小组成和粒径 孔径小 对微生物的抵抗性对微生物的抵抗性 经济环保经济环保 2 2 固定化酶载体材料固定化酶载体材料 1 1 高分子载体高分子载体 天然高分子材料 天然高分子材料 优点 无毒优点 无毒 传质性好传质性好 缺点 易被微生物降解缺点 易被微生物降解 一般用壳聚糖一般用壳聚糖 海藻酸钠海藻酸钠 合成有机高分子材料合成有机高分子材料 强度大 抗微生物降解强度大 抗微生物降解 聚苯乙烯聚苯乙烯 2 2 无机载体无机载体 稳定性好 机械强度高 不易降解 耐酸 成本稳定性好 机械强度高 不易降解 耐酸 成本 低 寿命长低 寿命长 玻璃 硅凝胶 铝等玻璃 硅凝胶 铝等 3 3 复合载体复合载体 无机有机材料复合组成的新型载体无机有机材料复合组成的新型载体 磁性高分子微球磁性高分子微球 内部含有磁性金属或金属氧化物内部含有磁性金属或金属氧化物 的超细粉末 的超细粉末 回收简单回收简单 3 3 固定化方法的选择 固定化方法的选择 1 1 固定化酶应用的安全性固定化酶应用的安全性 要按照药物和食品领 要按照药物和食品领 域的检验标准作必要的检查 所用试剂是否有毒域的检验标准作必要的检查 所用试剂是否有毒 性和残留 尽可能选择无毒性试剂 性和残留 尽可能选择无毒性试剂 2 2 固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性 在选择固定化方 在选择固定化方 法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定 能长法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定 能长 期反复使用 在经济上有极强的竞争力 期反复使用 在经济上有极强的竞争力 3 3 固定化的成本固定化的成本 包括酶 载体 试剂的费用 包括酶 载体 试剂的费用 也包括水 电 气 设也包括水 电 气 设 备和劳务投资等备和劳务投资等 4 4 载体的选择 载体的选择 最好选择工业化生产中已最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料大量应用的廉价材料为为 载体 如聚乙烯醇 卡拉胶 海藻胶等 离子交载体 如聚乙烯醇 卡拉胶 海藻胶等 离子交 换树脂 金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用换树脂 金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用 前途的载体 前途的载体 要要考虑底物的性质考虑底物的性质 如当底物为大分子时 只能 如当底物为大分子时 只能 用可溶性固定化酶 不能用包埋型 用可溶性固定化酶 不能用包埋型 若若底物不完全溶解或黏度大底物不完全溶解或黏度大 宜采用密度高的不 宜采用密度高的不 锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶 以便实现转化锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶 以便实现转化 反应和回收固定化酶 反应和回收固定化酶 二 固定化酶 细胞 的性质与指标二 固定化酶 细胞 的性质与指标 1 1 固定化酶的形状 固定化酶的形状 1 1 颗粒状颗粒状 包括酶珠 酶块 酶片 酶粉 每种固 包括酶珠 酶块 酶片 酶粉 每种固 定化方法均可制备颗粒状 方法简单 定化方法均可制备颗粒状 方法简单 比表面积大 比表面积大 转化效率高转化效率高 适用各种反应器 如酵母酶珠 适用各种反应器 如酵母酶珠 2 2 纤维状纤维状 三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶 三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶 混合 再用喷丝的方法就可制成酶纤维 比表面积混合 再用喷丝的方法就可制成酶纤维 比表面积 大 转化效率高 但只适用于填充床反应器 此外 大 转化效率高 但只适用于填充床反应器 此外 纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器 纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器 3 3 膜状固定化酶膜状固定化酶 可通过共价结合的方法将酶偶 可通过共价结合的方法将酶偶 联在滤膜上 也可用其他方法制膜酶 酶膜比表联在滤膜上 也可用其他方法制膜酶 酶膜比表 面积大 渗透阻力小 可用于酶电极 破碎后也面积大 渗透阻力小 可用于酶电极 破碎后也 可用于填充床 目前已有木瓜酶 葡萄糖氧化酶 可用于填充床 目前已有木瓜酶 葡萄糖氧化酶 过氧化物酶 脲酶等酶膜 过氧化物酶 脲酶等酶膜 4 4 管状固定化酶管状固定化酶 又称酶管 利用管状载体如尼 又称酶管 利用管状载体如尼 龙 聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺 经活化后与酶偶龙 聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺 经活化后与酶偶 联得酶管 酶管的机械强度大 切短后可用于填联得酶管 酶管的机械强度大 切短后可用于填 充床反应器 也可组装成列管式反应器 目前已充床反应器 也可组装成列管式反应器 目前已 制备出糖化酶 转化酶 脲酶制备出糖化酶 转化酶 脲酶 等酶管 等酶管 2 2 固定化酶的性质 固定化酶的性质 1 1 酶活力的变化 酶活力的变化 酶经过固定化之后酶经过固定化之后活力大都活力大都 下降下降 其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载 其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载 体发生结合 酶的空间结构发生变化或酶与底物结体发生结合 酶的空间结构发生变化或酶与底物结 合时存在空间位阻效应 包埋法中还有底物与产物合时存在空间位阻效应 包埋法中还有底物与产物 扩散阻力增大 扩散阻力增大 2 2 酶稳定性的变化酶稳定性的变化 包括对温度 包括对温度 pHpH 蛋白酶 蛋白酶 变性剂和抑制剂的耐受程度 固定化后 变性剂和抑制剂的耐受程度 固定化后 稳定性提稳定性提 高 有效寿命延长高 有效寿命延长 其原因是限制了酶分子之间的 其原因是限制了酶分子之间的 相互作用 阻止了其自溶 增加了酶构型的牢固程相互作用 阻止了其自溶 增加了酶构型的牢固程 度 度 热稳定性提高热稳定性提高 热稳定性越高热稳定性越高 工业化意义越大 工业化意义越大 热稳定性高可以提高反应温度和反应速度 提高热稳定性高可以提高反应温度和反应速度 提高 效率 效率 对有对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高 机试剂及酶抑制剂的稳定性提高 pHpH 蛋白酶等稳定性提高 蛋白酶等稳定性提高 A 操作稳定性操作稳定性 通常半衰期达到 通常半衰期达到1个月以上个月以上时 即时 即 具有工业应用价值 具有工业应用价值 B 贮藏稳定性贮藏稳定性 一般不能长期贮存一般不能长期贮存 现做现用 否 现做现用 否 则活力逐渐下降 若需长期保存 可在贮存液中则活力逐渐下降 若需长期保存 可在贮存液中 添加底物 产物 抑制剂和防腐剂 并于低温保添加底物 产物 抑制剂和防腐剂 并于低温保 存 存 C 对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性 大多数天然酶经固定化后 大多数天然酶经固定化后对对 蛋白酶的耐受力有所提高蛋白酶的耐受力有所提高 可能的原因是由于空 可能的原因是由于空 间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部 间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部 3 酶学特性的变化 酶学特性的变化 A 底物专一性 底物专一性 对底物的专一性下降下降 B 最适 最适pH 最适pH可能变大 也可能变小 pH 酶活曲线可能发生变化 其变化与酶蛋白和载体的 带电性质有关 C 最适温度 最适温度 一般升高一般升高 原因是固定化后空间结 构更为稳定 D 米氏常数 米氏常数 Km Km值均发生变化 有的增加很 小 有的增加很大 但不会变小 E 最大反应速度最大反应速度 Vm 变化很小或不变 4 4 评价固定化酶 细胞 的指标评价固定化酶 细胞 的指标 固定化酶活力测定固定化酶活力测定 单位 每毫克干重每分钟转化底物的量单位 每毫克干重每分钟转化底物的量 活力回收率活力回收率 固定化酶总活力固定化酶总活力 加入酶的总活力加入酶的总活力 相对活力相对活力 固定化酶总活力固定化酶总活力 加入酶的总活力 加入酶的总活力 上清液中未偶联的酶活力 上清液中未偶联的酶活力 偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定 偶联率 加入酶活力 上清液酶活力 偶联率 加入酶活力 上清液酶活力 加入蛋加入蛋 白活力白活力 3 半衰期半衰期 即酶的活力降为初活力一半时所经历的即酶的活力降为初活力一半时所经历的 连续操作时间连续操作时间 T1 2表示表示 4 热稳定性热稳定性 将固定化酶在不同温度下温育 将固定化酶在不同温度下温育1h 在在 最适温度下测酶活力最适温度下测酶活力 一般保持在一般保持在60 以上以上 三 酶传感器三 酶传感器 一一 原理原理 将活性物质酶覆盖在电极表面将活性物质酶覆盖在电极表面 酶与被测的有机酶与被测的有机 物或无机物反应物或无机物反应 形成一种能被电极响应的物质形成一种能被电极响应的物质 1967年年 Updick和和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶将固定化的葡萄糖氧化酶 膜结合在氧电极上膜结合在氧电极上 做成了第一支做成了第一支葡萄糖电极葡萄糖电极 此后此后 这类酶传感器通常是通过这类酶传感器通常是通过检测产物检测产物H2O2的的 浓度变化或氧的消耗量浓度变化或氧的消耗量来检测底物来检测底物 用葡萄糖氧化酶电极测定血液 尿 发酵液中的用葡萄糖氧化酶电极测定血液 尿 发酵液中的 葡萄糖浓度 葡萄糖浓度 用脲酶电极测定血液中的尿素浓度用脲酶电极测定血液中的尿素浓度 7 4 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器 酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图 过程调控过程调控 生物反应器生物反应器 消消 毒毒 原料原料 预处理预处理 产物分产物分 离提纯离提纯 产产 品品 生物催化生物催化 剂制备剂制备 空气空气除菌除菌 能量能量 热量热量 常见的酶反应器类型常见的酶反应器类型 按按结构结构区分区分 搅拌罐式反应器 搅拌罐式反应器 Stirred Tank Reactor STRStirred Tank Reactor STR 鼓泡式反应器鼓泡式反应器 bubble column reactor BCR bubble column reactor BCR 填充床式反应器填充床式反应器 packed column reactor PCR packed column reactor PCR 流化床式反应器流化床式反应器 Fluidized Bed Reactor FBR Fluidized Bed Reactor FBR 膜反应器膜反应器 Membrane Reactor MR Membrane Reactor MR 按按操作方式操作方式区分区分 分批式反应分批式反应 batch batch 连续式反应连续式反应 continuous continuous 流加分批式反应流加分批式反应 feeding batch feeding batch 混合形式混合形式 连续搅拌罐反应器 连续搅拌罐反应器 Continuous Stirred Tank Reactor Continuous Stirred Tank Reactor CSTRCSTR 分批搅拌罐反应器 分批搅拌罐反应器 Batch Stirred Tank Reactor Batch Stirred Tank Reactor BSTRBSTR 二 反应器性能评价二 反应器性能评价 固定化酶的形状固定化酶的形状 溶液酶溶液酶 回收困难回收困难 只适用于只适用于BSTR 颗粒及片状颗粒及片状的固定化酶对的固定化酶对CSTR和和PBR均适用均适用 膜及纤维片状膜及纤维片状的酶只适用的酶只适用PBR 固定化酶固定化酶易变形易变形 易粘及结颗粒易粘及结颗粒时时 采用采用FBR 底物的物理性质底物的物理性质 溶解性和浊液性底物溶解性和浊液性底物 适合任何反应器适合任何反应器 颗粒和胶状底物需要高速搅拌颗粒和胶状底物需要高速搅拌 反应的动力学特性反应的动力学特性 CSTR型随搅拌速度型随搅拌速度 PFR型随流速增加而加快型随流速增加而加快 酶的稳定性酶的稳定性 高速搅拌高速搅拌会脱落会脱落 避免避免剪切力剪切力 减少外界环境影减少外界环境影 响响 三 酶反应器的操作三 酶反应器的操作 1 酶反应器操作条件的确定及其调节控制酶反应器操作条件的确定及其调节控制 1 底物浓度的确定与调节控制底物浓度的确定与调节控制 2 酶浓度的确定与调节控制酶浓度的确定与调节控制 3 反应温度的确定与调节控制反应温度的确定与调节控制 4 pH的确定与调节控制的确定与调节控制 5 搅拌速度的确定与调节控制搅拌速度的确定与调节控制 6 流动速度的确定与调节控制流动速度的确定与调节控制 2 2 酶反应器应用的注意事项酶反应器应用的注意事项 1 1 保持酶反应器的操作稳定性 一定时间后 检 保持酶反应器的操作稳定性 一定时间后 检 查酶活力 进行补充和替换查酶活力 进行补充和替换 2 2 保持流体的流动方式和状态 流动状态的改变 保持流体的流动方式和状态 流动状态的改变 会影响酶与底物 产物的接触会影响酶与底物 产物的接触 3 3 防止酶的变性失活 防止酶的变性失活 控制温度 控制温度 PHPH 金属离子 金属离子 剪切力剪切力 4 4 防止微生