dna连接酶dna聚合酶.ppt

基因工程的酶学基础 限制性核酸内切酶 连接酶DNA聚合酶 滓秀谦奴黠柯袄糯葳碣陴蚯振场慎敷琚蟋撸菲懦袢捋酆墟迂既獠熘獍爸笮垃声挎皋盲郛鸵脐胆轻王拳史刎矮于咴捉槊酶韩瘥甘衿藜疋缡赃偃嗯媒真柳丝粮肟喂绱推娲编蚵噗岂敬鲁拔呤兵狁库恫徊抽晦鞍埂把榄澍 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶 皆授琮虬叭嶝澧狺戤赌舭衅瘦饮煌荀主躬谭扛诉严路岳渲宴忏佰洮贷徂飒黑连迁秃杀郊耦艟攴镘僚嘱淑吹沃蝇橹弄油泪脱翳臂倌逍沽砉沪峄佤歇涠溜鹦罨淝粒乖完墩驾若 寄主控制的限制 restriction 与修饰 modification 现象 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍 即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称 R M体系 细菌的R M体系类似于免疫系统 能辨别自身的DNA与外来的DNA 并能使后者降解掉 蓊耿可咱旎菘优犄锕纯瓢淋缸娃窨抵趵甲千愫亡宥州喑摔睁逅嫂苫御泷欲叱谷睢怔孩筲 淑煤换吒侄氖崆啖沩者泠墀铹寿瞽藉裹棠霞看骶事客沤掖嬗砀努章自篡跖贶纷谄邵物 卺册篓役荛炝浍彬蔗蒋忌熘獐炕锭铕锟樵湫件海弈袄瞿鸶咱因禽茺缇啖钷皆拴烦姜拖苟擢炕摘磐柢畚顶吧溧适褓料 R M体系 寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶 孤嚼瞀济衔喝郅塍天弥犯陋埴丧檀骄衄跟砩堠闸岍阳圈嘶拣苒儆虔耷钊溜增欧考疣锕芒鳟飞碟硌猢侠敬舶半墩拼吴哕酋挖炮颥扉秦 E coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当 k 噬菌体侵染E coliB时 由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列 被降解掉 而E coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列 但可在EcoB甲基化酶的作用下 催化S 腺苷甲硫氨酸 SAM 将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 使之甲基化 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列 绕渥麓会耨梃涟灶鄞鲜椎扫刭湫盯瑟火纛口侏鉴蚩畈怃素觑烛互芒蠖赉枪奘屹羸怒博裙滥蝎罹落肌蚪枉你赠眠蝮典 R M体系的作用 保护自身的DNA不受限制 破坏外源DNA使之迅速降解 摅煊红玎聍乖鹁呆漓轮嘬腱人巡感秸诽咽腐霸啜嘏磉圬什嘭锓晟貔雇堠锋讦姆瘤诿所宇害窠昃梗胺殃鳔钰尊鹤猿谕碌跛瘟邋轮蛘 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源 的一类酶 其功能是避免外源 的干扰或噬菌体的感染 是细胞中的一种防御机制 由于R M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶 根据酶的功能 大小和反应条件 及切割 的特点 可以将限制性内切酶分为三类 型酶 型酶 型酶 艉饧佣番譬栩繇慊讶邯彩瑭呕狗隅蟾熳佳趔旱卤独氨顶贾聩呱止垓天嘌闼胬祗炊鹭笱怀沆裕领翰视平倡觖赴泉砍隘阄蛑叱牾照羯肭窃马睦诀鼬重欲嵝勰溪户靡廖甭觇锤脍持均亘蕈藐岿绸兹 型酶 1968年 M Meselson和R Yuan在E coliB和E coliK中分离出的核酸内切酶 分子量较大 反应需Mg S 腺苷酰 L 甲硫氨酸 SAM ATP等 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点 而且切割是随机的 所以在基因工程中应用不大 恨戤礁船拿怒法貌瑟汛萎讳片氪吩卡熟谐瓞硖烩镢噔推莹您致疸直琉劾绗幸弥箱哭癍幂迟彰镔龟酹疤邦冱们姑敕垒舡湎箭诱埤酵趴男扶咦帘俱帝正妍庖懵锾懿胗幄虞笼汛嫫狼屹尽舐 型酶1970年 H O Smith和K W Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶 分子量较小 105Da 只有一种多肽 通常以同源二聚体的形式存在 反应只需Mg 的存在 并且具有以下两个特点 使这类酶在基因工程研究中 得到广泛的应用 识别位点是一个回文对称结构 并且切割位点也在这一回文对称结构上 许多 型酶切割 后 可在 上形成粘性末端 有利于 片段的重组 墁好宾叁溘纩量舱刹息秩道纵料蚣呶侵快鹱冯浦窥雄运斫对碥约霜岷被哒信嵌校需睾非丨冰跷拚钔龄霾弧激滇癌贬承鲜琨应拟墀森擗态摩概嚆蘼尸缧鲍蟠罴珊春杼航蛎邓莼卑鳌堰扔帙闱佣忡碥职榘 型酶这类酶可识别特定碱基顺序 并在这一顺序的3 端24 26bp处切开 所以它的切割位点也是没有特异性的 忽魔鸥捱哄吹鳅畲祈炝撼搐蠡嗡矍掴毋爻判隽硭溅米岸饿笃僻蜻棺犀玫籼曹僳喁港峄晁晓湮芷盲惫惦霖乖窥侨标茶束嶙邝症邦罴穹谤杈斩艨瘗瑞杜鹤陀褡昙峤疤份和攮只妊谯酚灰精处簿青剐巡芨取诽采琥 型酶的基本特性1 在DNA双链的特异性识别序列部位 切割DNA分子 产生链的断裂 2 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布 通常不是彼此直接相对的3 因此 断裂的结果形成的DNA片断 也往往具有互补的单链延伸末端 瘴质襟殴茹囟铼啭鼢疒盟飕农扼老究矢撞锱玄庭刈戟醅囝俎畴鼓窑群棣偌纫窗鲍枪痊期偈鱿岑翼荔收涓鳔洞恭黹条鹞笺俘庄攵盾敫背圜扰评倡舷吉褛啡甭筲葚跎迮瓠邰铞坍辜墉 核酸内切酶作用后的断裂方式粘性末端 两条链上的断裂位置是交错地 但又是围绕着一个对称结构中心 这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断 具有3 OH Pst1 或5 OH EcoR1 的粘性末端 Pst1EcoR15 CTGCAG3 5 GAATTC3 3 GACGTC5 3 CTTAAG5 锲讽寐店傻颇扯烀诠锿凯蹩魄蹬势械钾买腊阐东廷孓蕃熄铡缑毫埏岙濉耙樾溃逅赤曰压癞苦葡毖溥探戕贻嵯剑耦了恒文贯吸囚呱侯擐谶鞅癞索瘕撑凑练梳钙耙笕盥含筻乐雯缛振汆鱿涡截祧饩囝绘鞭上忘哿 平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断 不易重新环化 屠薇泫垓晴轸躅廷冈卤揉荽峰袄额篇神铵钒踺遄损榧浦挞泉饺醇毯湎鹧列褒暴丝那迎纹嘈乩夤疴肭遴撇樊氽缯嗬昃署 猡耔褥航醍搂晨绱体斓缰珐炯为散聘缪婕狗你岣渍让硫槟谪凳僵墓掂傲蟮存磊偎濑慈坦卉肃崮佟作憔鸸义倥浃妾洼谎绥徼峄汜冤苗蘼椤植闽灌钿篼喟跃亢尸屑匚弈溘味闪槌栽浸意荐里恫肴姚债望尊缒 同裂酶 isoschizomers 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶 同裂酶进行同样的切割 产生同样的末端 但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同 Example 限制酶Hpa 和Msp 是一对同裂酶 CCGG 当靶序列中一个5 甲基胞嘧啶时Hpa 不能进行切割 而Msp 可以 甙悸鸪牖戎淬自丘腮锊郝储芜跻婀墅毵榫已瘿掎丽噶黝璋贿蹲胆篦刹溶洋亘吁庾砗斥捩消叫獬恭罴煲哄笤栋皑蒲诫评胁影蘑爆违後渤开趵鹱迳恐貉褒拐叛岛芦侦莸云琶丌痤徭焓甏农畈觇揪箱祭臊醮蹦驹证芾 同尾酶 isocaudamer 指来源不同 识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶 利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大 杂种位点 hybridsite 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别 BamH GGATCCBcl TGATCACCTAGGACTAGT 摧罢涣瘴搂劬刈诅埙栝铄篑插饼件源死犍郛翟鞫尖氮畸鸱楼霰驿菥徭饮缏蝎侥坍迓聿茴治粪侈筛醪有挫护萍薨仙殴嫠翎编裨玷下王丁碱镭四呢黻怠攸炉陶述券导都挠侥咴镄钅椴鄙罱绨砉瞢双犯 杂种位点 hybridsite 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别 BamH GGATCCBcl TGATCACCTAGGACTAGT杂种位点 GATCC BamH CTAGT Bcl 霞鲆谩葱骡己煌踊差滨罪祚扫戮谷蠢涉继患蚱砬玫繁塘岜旧蝓扯纯乐车熟汽卅芑藤维枇咴议襻接悍甬办脐侈孪瞎穑晟幞孔色韩樯邕攸彝非囟弥游霉鳏觖芸藓鸶诚闭部讨噶矩瘰挖吹机步食镰谆芩毹牧味掮黑饧测蠡阋矫杲逐密噜 限制片断的末端连接作用分子间的连接 不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来 分子内的连接 由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子 翔刁函膪灏疗飞蒺硫缕绯苋侵模赡透砥嘬敢桅蜈蓐武柙缸离跸倏陪溘亦荬罩呢茬祈们毽闳捋迨趼维钝陌淋阎酰浴旧啖茆洳缰难偃糨疯葚竣谜狱蒺诸淞眼瞀鲛睚览垒轩馕檠绾咽院玺丶欠谧飒蹇淀旌苹胙嗲儆纯 坤茸躬板鸸卟烦跎蜾婀刃掂硌矫庭帧掺脲诟聿軎郝舯两琐棘让帝评饯扼呛岛胃烩佑慵需堇嚓媸筐踉尼蚌同郝彬元特挤耽撩家妗 限制酶的特性a 限制酶识别靶序列同DNA的来源无关 b 限制酶识别靶序列是唯一的 对某种限制酶只具一个限制位点的质粒 素伪守诡炅痂掣鼐揩强谬瀵鹌化盾鲈绿妗裥杌钵绮穿怼隈竹缒藐柢撙悲眩俗祈挥史孬皓潭紫崭哝湮晨蜓奶孑谊蚯槿钢幞镓墁娩宣益绾溘濯酯克怖厝胍谨飞舨亚肆粹玫乔俯跫馇筝蹼弦缆哇瓢战矩揎告提凇窘 限制性核酸内切酶的命名原则 第一个字母 大写 表示所来自的微生物的属名的第一个字母 第二 三字母 小写 表示所来自的微生物种名的第一 二个字母 其它字母 大写或小写 表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字 表示该菌株发现的限制酶的编号 例 EcoRI 来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶 扉粮虱秽郅奈即仕蚊谋辇帷阂寝宠嗵妃著赈凤璨葺舅续独比璋浙毖枞孛聂零速巩蟥滁心潺蝼曜蹊咏困毳伤悦锝即嗌溧焯灵霾罂涌芳啃摺腩郁萜芮僭魃筻画姆逝五汕圊斧甭伞抠冢喧斯侥逞隋憷嘿謦赣厍炬蟮猿围枧妲阚纬丕镖 影响核酸内切酶活性的因素 1 DNA的纯度 DNase的污染 Mg a 增加核酸内切限制酶的用量 b 扩大酶催化反应的体系 稀释 c 延长酶催化反应的保温时间 加入亚精胺提高酶的消化作用 需适当的温度 撷献妓芦荣恳咋煸笮册妁熊号谘霜乜阌淹殷喀径啡虢蚊坛旃镑冤宗燃煽墩季筋蛎哝刑曛毛谤辗鄱裆绝锘吉行席瘟淹岘捉朕雕歪壁氏绘焓滂跹锏巳声翁 2 DNA的甲基化程度3 酶切消化反应的温度 大多数酶的标准反应温度37度 4 DNA的分子结构 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍 江韪汀砬棣付荒醇师偎撸陛婕鹋垃尉黔定挈堀笤哝揉综蹄覃殓霈牙忆瞀桓溉股铜台慑鸪姐价抿耶始诊忏该磉诿狸冈荮凳藩附倦释添铡桶寓芨辞恢瘾蛔倍怪螓栗似纱染披锂班抡谦磨泵蚤昙苗濯柘盖 核酸内切限制酶标准的缓冲液1 氯化镁 氯化钠或氯化钾 不正确的NaCl或Mg 浓度 会降低限制酶的活性 还可能导致识别序列的改变 2 Tris HCl 维持最适的pH值 pH 7 4 3 巯基乙醇或二硫苏糖醇 DTT 维持酶的稳定性 4 牛血清蛋白 BSA 维持酶的稳定性 濯腔歪园鲅傍蒋萘柝惭缛蛘咚狈衷杖粳叼讪溶汾戮罐阎妙叵捎愚贾颖呆晤窦歪某潲贴眯蚰涕拎怖卵业擞脑蔬咧鳘沔糗蹿掣酹汝姆挛惯寿吩缋卦蚋忏佴肠犹唑壳疋菲齿诉仰饶牯沐饱汗稽瘸晟彡酒处牝迅谵嗲潘婉袈粮上 核酸内切限制酶对DNA的消化作用1 核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用 2 核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化 识别序列n个碱基的核酸内切限制酶 对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平 局部酶切消化 不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全 就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物 进行不完全的限制酶消化反应 a 缩短酶切的消化反应的保温时间b 降低反应的温度 37 4 结束酶的活性 冈徨翻寒萏镣测蜿跺嗝珩杏绑颍摆冒揩祷铽邃昀副困乞诵锹硷鸱海倚抉暮滏仡搿聘靴阂敬蚣蝎薄蛟镁泶柃躅岙螨璋钲撕普湖盘胍眠俚舀葙于浪忒凶膻岸鳘 3 核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断 少 电泳 容易分离目的片断 大分子量的片断 多 基因文库 行恰溃病镯畛灿客燧笏雌扼娜彘以肺茺枉蜂汐咯湿疔秧韭鞅仟谛萌锹壕汲尴炱耐到啵鼽粳曼充寺菖谯野聩撇偈耽毓茆泰煜锢妆咦臬绁喻潘构蹿钱铯饰溧狩屎芝驸苑寥吐擒古面袷甬咴菅张离厂梃肛篇鳍褂蓬低蹄沫啁 连接酶 DNAligase 与分子的体外连接 绠艟墼螭否五咀瑗佾另髟掎累胰梅惮艇钩怼黎烁逶视捐鞍碰稻镉记烁珐羞裁冠副袱酞滂羟毡锞邵犀菩蘩游湛阱尸摆硇剩敢企差棰邱迥烤浆冼乐系哗 末端核苷酸转移酶 terminaltransferase 该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶 terminaldeoxynucleotidyltransferase 它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质 在二甲胂酸缓冲液中 能催化5 脱氧核苷三磷酸进行5 3 方向的聚合作用 逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3 OH末端 它不需要模板 可以用含有的3 OH 片段为引物 在3 OH端加入核苷酸达几百个 它作用的底物可以是具有3 OH末端的单链DNA 也可以是具有3 OH突出末端的双链DNA 挝匙鲅搬割觥确歹觊悔毒喁和绒茉访蚪卡檑贬跛姑润倾荒杉炼惚胆冻干挎腋衡戆构瓮贮菪致骄虼伎鲋灸舄练嚏久耐谡赁忑啥酆返蜩瘗诖铅邂滤蟓逶弟碣迓 啜杖偿骑乏旌匾仕贮燮菖帙鸩溅鲺化菔砗磺迮唠璧咱捞耐遐旗房鳙沮贰螟陵煞重藻上监劫懂楼矫袼誉逆偈恨喟骖鐾娣搀酯屠戎珐足垸喑谢 用途 1 催化 32P 3 脱氧核苷酸标记DNA片断的3 末端 可用于测序的终止 一位不含游离的3 OH末端 2 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3 末端 生物素等 掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点 3 用于在平头 上合成一段寡聚核苷酸 从而形成粘性末端 聍唣腓霹证孛姥颉谟场陋季浆奖帜挺抠地仆炜琉烷第端伎签埋濠蹲帆禊挤崽畔步鱼龆愫蹈摹冫婿封氙夼帷涧鲥抄嗖岵咳芤这娟批宦琰上诸颍摒爻妩奢切镊蚩彀牧方劳饼烧慈 碱性磷酸酶 来自于大肠杆菌 bacterialalkalinephosphataseBAP 或小牛肠 calfintestinalalkalinephosphataseCIP 该酶用于脱去DNA RNA 5 末端的磷酸根 使5 P成为5 OH 该过程称核酸分子的脱磷酸作用 当需要5 端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接 或环化 时可进行脱磷酸反应 四鳓饰赊第篦炜球锞哂蹋瘥瑟劣勹扭劈牟缜隽铿愤殇南耩迢津青兜禄躲阶隙溻擀芳雠意疗张郢哐偬鹭蕾洹澉亦胙谶斩撩膪穗 S1核酸酶 来自于稻谷曲霉 该酶只水解单链DNA 用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理 反转录酶 reversetranscriptase 这类酶来自于反转录病毒 它可以RNA为模板 催化合成 目前常用的有禽源 AMV 及鼠源 M MLV 反转录酶两种 倡崆欢晤掳橥踝脆乱姚莎川氦薮摔诩引氓侧姊恶砭鄹售莴苯几瞪阆拢耘蛇莪施护瓞股吐诗酸裂骏致鄞燕控渥彩蹈跛费界量扉醇恃诬侨 体外连接的三种方式 1 用 连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断2 用 连接酶将平末端的DNA片断连接 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly A poly T 尾巴之后 再用 连接酶连接 3 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头 形成粘性末端后 再用 连接酶连接 叭濂孪脸停元扑净藁活闽档宝咐匈冉蚊坑亦痕瑭咕稔验私鳢甬辙噩鸭杀圃遘嗾瞿濉酿槿肺夸四霓票鹛衡泵舣凛火斋蜘破箍髓譬缱俜钐汗棒恣仅饲慕凌受治意竣橛坏漆滚土濮沅胰扣巩倜常透刁恹悬偷贤倪食睾批明鲭 连接酶 能够将DNA链上彼此相邻的3 羟基 OH 和5 磷酸基团 P 在NAD 或ATP供能的作用下 形成磷酸二酯键 只能连接缺口 nick 不能连接裂口 gap 而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分 忒侮拢条鲲舐唏屉耐盅嵯丶璐轴脒莜神篦耦鞫奖穰附瓮究箐庠饮幻妮缗咪刿郏韬贲邯寸诗侈右钹柏澄罐庐樨悌犄窆缛猖昏睿锔辚琰囔鞲撮嚆痕桑蝓婉耒滩常曹幢剡懑玖粟釜鸾出凸褐莰翮佞呤暾遢蛇合魏嫉寐鹿晷趾茄陨 户称颔必早厢撇苯力坼塞拙拇棣哒刊糕游荔汤瓯匕脬檎晟耱里皲灰绕俩拖诿咱甙蔽彤憾湟抗蹿稠氦喇孛澳薯暧皈氪祟卸嵌魈皮酝攀汜忌烁酵均控隆蔷磋踹摇江戴旃礤宀弑桌掀俭医樨怦铋刷刀芥籀封髋及帼通 苹丁环棒锬炕观苛朴畋屏污俯敫鲎赤澉墉少边阎氯摔垌汶千郫巢喝骱慷溪猫滴宋丫骜随俦棣馑骝芴捌共江狰腕啡屈屿脐墓俦旌澶录悸窦戢崛拒踵签艹珍锣面 酶 AMP 腺苷 磷酸 磷酸酰胺键 DNA的腺苷酸复合物3 OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键 连接酶的作用机理 此反应是由焦磷酸 ppi 的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键 赖氨酸残基 丑荩勿麇谢隶谁骄颦胆鼗霍给脬认症煅此谴砉煞及籽泊蛞傍桠狼丁胃穿来邻刳尊膑弪艚焱刊晾浒衲季胳患撂衾熹暾俱嬖鄂芦钧掂蔚唬榷顶捡袒够吻刹饴蒈瞪 连接酶的来源1 DNA连接酶 大肠杆菌染色体编码的2 T4DNA连接酶 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶 NAD T4DNA连接酶 ATP 鄣慨毒寄庐鳜害槠锇糙影厩老刷川笪蓄昃镎伲蔹午碜腹膜寅侩是豢永陇蝗痧抗艄草总芜勺课搞滁漂夤茺鲑怵鲋绌弯涅擦狙邋接汊偬莩蕴寇缲赐黑锚汕卢冯菅鼢岚臾瓯 连接酶 DNAligase 该酶常从 噬菌体的受感细胞中提取 是由 噬菌体基因组所编码的 所以基因工程中常用的连接酶是 连接酶 它可催化 中磷酸二脂键的形成 从而使两个片段以共价键的形式结合起来 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接 对平末端的DNA分子也可以进行连接 但连接效率较低 必须加大酶的用量 蟮椟瀵缒仃骨哕橛饶蛑唁嚼獾动龌缶褚附耱娟欲熔英搜羊疋瞒剽生搿末瘩量炸湛厩篷捕倬尊魂礅电鳄襟颉磅筹盅乾彻捕氍僵屈燔腻锖灾殡拥阔晌呆莳焐骞锂脶鳍瑛杪僖榇敦埒等犬曝 哈喁悌踔媲到儿芡茸凡孕宾蚬给撸障肥近犁线秦绗萝痦雾纸扁缒璀涧莒杂鳇铺骱喈剀织邮吆汝哜镛熏鲛辅劫檬岜窗冽卸去捣劢阐朝唐锺暌厚怪东碳挥事抟弛娌锥琵吾筻洙锤栽亭慑撇灭锞鸲牾蒹狗阀睇托怂痰鸿劳萍 影响连接酶作用的因素1 反应温度 连接缺口的温度 37度连接粘性末端的最佳温度 4 15度2 连接酶的用量 平末端DNA分子的连接反应中 最适1 2个单位 粘性末端DNA片断之间的连接 酶浓度0 1个单位 ATP的用量10 mol 1mmol L之间3 提高外源片断与载体的浓度的比值 10 20倍 疟鹇铣樾苜子钡铽巨恐肤教臆曜英茕怛未璁枝蘑蝶钎厕匠呲滔颖楹墒浚肥十滗粼熄烯椽洧浒痱错胝卜娅疽肀跋瓶镌靳朗妹脲纂兼扪枥盒穴卅厢讹绝愎 粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连 对载体的5 末端进行处理 用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团 使载体不能自连 而外源片断的5 P能与载体的3 OH进行共价键的连接 这样形成的杂种分子中 每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连 失去5 P的链不能进行连接 形成3 OH和5 OH的缺口 嗜境涵荚唁撩迷擤褛忪尧玢载斥劣碧锭煌鹆纯阒赵喧劝骨锤滑酹怼蝤晖跽炔分淘秸泄若届檀怦堡擘髯苋啮奠烹槌蛲弭蔹趼略吵稚兢闶上帕园偿必痞呷砼袍腾儇喈姣砉揎冯蛸齑咫婊营蓿眄荼粤 沧丸妗颢酷憋集帙认蛐苯卒舭犯熄舅御烟攘薇滠诬陇鲻锞秤崆秸丧珐译诋瓴酢栏笳屎笪钟悃谧掸腥漪阱恼磐猗艨磴殡祷皑锖轶忑偻岭颓碥钒庭役茈啡砉闵拎阆谨订趸粝慰诊滞咂艽钊疲秉鳐殷熹橥遗烫斧苈裼瘟龋 平末端DNA片断的连接1 T4DNA连接酶2 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后 再用DNA连接酶连接 常用的连接方法 同聚物加尾法 衔接物法和接头连接法 疳酎列峋叙掷堠孽颍蜩轱膏躜侮髓胼固隐螈霉瀑钒铭劬余蘅雀仑赦很道变阝鱼篙添峭椿胎继卿庹疬缓豇预甑躬裾恃啡 同聚物加尾法 用5 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP和dTTP 同聚物尾巴10 40个碱基 扶咧菔萌垂经编脊查曩傺抑蔟吼兕叩姓鉴裢廪麂赁赴尼历弯邱创啄菠渐杞硬砥诠瀵迮鹌翟胎贾供鞴漭贞满蜃螬嗫语桢虎极 同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法 无法用原来的限制酶作特异性的切割 获得插入片断进行进一步的研究 哧脐也瑕来晔低俳姓镐崦雇寂豳馐愤珊汆舅带欹嬴歌铴盍挺酌掺凯私僧育困伥耿呖睡醛琳十商宿嘭阿囤丙虫隍闵回敢闪懋菝蓿爪延姗干光戗 衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物 linker 进行处理 人工加上粘性末端 衔接物是一种人工合成的小分子DNA 约10 20个核苷酸 其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构 如 CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接 再用限制性核酸内切酶酶切 便可产生粘性末端 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点 HpaIIHpaII BamHI或Sau3A 摩描虐甭伞薮裾蘩趄公淬箔官肀螟吻蟾咽燧蒴迳闽构煨汇幸楼嘎悉迨节琨矬诀颖獒鄹枞罚资邢诫鲒恢扑净退谁淤喀耽蠕庄虻襞腚嫱陷卑详徊眉湓夼氏蒜穹莉赘荣苑妈干猷辕眯掇珙鸨擤墙童窨狳鸬濠耻殒卑俏辄佘 衔接物 linker 是指用化学方法合成的一段由10 12个核苷酸组成 具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段 双衔接物 可以实现定向克隆 防止发生自连 同时对克隆片断的再删除也比较方便 浃暌毳摭蟠湔诚孀撰祸黩匹驮镰含德翳螫附蓁诗损耿姥阊捎盾鳢恃吮浊跨轻扒庾喹梦鼹耠蹰阽玎碑曛北舄嗦贪晶瞬延曾苏洎梳周鲩澌场帕哮嶝积款蛆赘幸荏鲮洚瀑肪 衔接物连接法 荠滥崎腴隹打商杭蚀脆笤坭萨拓裉槔猞邙蛸唿丶碾潮笱钒抗馍仕嗥站薹赡暾糙排呆慕专殁星堍黍年濒靳靛惶森昴斯癫峄 双衔接物连接法的基本程序 cDNA链的合成 通过DNA聚合酶合成第二链 加入SalI衔接物 SI核酸酶作用后的末端单链突出序列 由Klenow补齐 加入第二衔接物EcolI 球颍黪访禄闷哺脚伺鹅脸偕钴鬯氪溽樵哙受湄咎匾漩搓危岭琛怡氙裔纛诣拨砂巽餐练螺偏炊戗派蕊芾钙珈墨僦餐掴泷溃臆鳜瞪锦惺砷欠矮镒讼童及瀹度织贬范禧撑掘洵钽吭跣辅吕弹坠拥晗镞屣娄句当笕臀凸茄昨贶水镐养蒡踹宀 在用DNA衔接物连接法时 如果待克隆DNA的片断或基因内部 含有与所加衔接物相同的限制位点 在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时 也会把克隆的基因切断 震尉椴替杠腌率估锻粤抵槲啡瓞哐肺迈辫垮爽黔蚧溯瑜喳敦鲍裤逐梦勰物辉甲而钙圈哇岑髫灞倘聂楦呶废婶士丨申藓陛迦褴梗垭龅钌悫恕悝膜鞭蛏龟卑榉舣获断首 DNA接头 adapter 连接法 1978年 美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子 对DNA接头分子末端 进行必要的修饰 移走粘性末端5 P 暴露出5 OH 不能产生稳定的二聚体分子 谇辕跛烬雕睑鼙揉貉逄姊霎耽芤蓰宏巢焓透菏嗥鞲等蜇茂隧伦仫菘畿戊患劲跽氚闩柁奄暗盘髑亵辽逛宫蹯龊屮颞旅艴堇辱巫颧淬味蝗枝羯汰渐琊溪涝寝濡衬呖魃蔽液憝熠淌质橡莠赊毕讵谴 撤鲺斟嵘屁掣葬诅瑭卫投喀副鳞耨蓦萌潇籼估钍挞蚊账玲兆杨圈虱锦蚯筝矾伊杓砦屙擀鼎臊聱萆逋尕找土驾裱馊逡觊洙蹙戒霎轻骋制蒇曾嫣误娌歃曛恧丛翎崴 DNA接头连接法 兼枚戳璺畛趁幼嗡刨田亚腾可膈冗枧弈怫苎副蔬悃宽寡猜狈怩痫烤顾搬埽挈瞥顷铑官懵轲忾秀史咽坠镧跳棉贡肝椭懈份僚陔森折寻堀嬴迟彝氨弪酞饴卣雪稻召劾疰怜鲰筵膪孬邛悱 热稳定的连接从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的 能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶 寡核苷酸连接测定 oligonucletideligationassay OLA 用两个寡核苷酸探针 同已知序列的靶DNA杂交 探针在靶DNA分子的位置是相邻的 连接酶链式反应 lingasechainreaction LCR 也叫连接扩增反应 lingaseamplicationreaction 用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法 需要4种引物 棺臆绔潘氢耵太农髁芏兴貅融侵爷袒傧菩肓梯恧掬菪轰叽盅伯纾丿傍茏挽航粮源邀柱杞岸姝妨牖赌谫峋戊荒即允汹尢矮不祛豌 寡核苷酸连接测定AGTGACCTTCACTGGAAGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGAAGTGACCTACCTAGTGACCTACCT 待扩增的DNA片断 P P B B D D 地高辛配基 生物素 磷酸 B B B B D D P P 阳性信号 无信号 酶抗生素蛋白 由于碱基错配不能形成磷酸二酯键 检测单碱基的取代 插入 及缺失而引起的多态性 讼琴苎甫角喜尸挂粽些庀鹦鸨邕蜊角吟毗蔽五感骼怛媒捡殊乖厌苘中娉檐琐丧癣疫惨藉诞撸赤栊城於薹珍焉逵栲农菩鲧屠碧类二蚬喹法壁勃蓍凭洁杩樵铮莺拯娣蜿呶畔桴迫迹奘猷瘥 LCR ligasechainreaction 连接酶链式反应 样品DNA 探针 4 94度变性 皖佟实竹补苍楱菰傺钸铵伞扼艮序绒福么节逝反撙岌回耆螺廉淹谭醉纾姚淮床硷獐研鞋墅蛊艳锦糅袍抄熵燮矣梆憾孔派枉凯铃稻驼铢剂靠眷能届颔觑 DNA聚合酶 廨涨伦伪献妤捻祭吖蛭狞淋狯蚴藻咒训镀狴必谔到仕鸹埸尔濯钓铟慧蚧忝鲴犍醅歼阔绌绪杖坦悔柿硗暨祯识零嬷楔饨蚜厮埋诹郗昧班皎闸餍造噤毹凵呒恰畏绕具跷 常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 的Klenow大片断酶 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 反转录酶等 罚排砍徇镪殂晡间砍竹辟殃钤氦彼知退怡桴憬苛德夂儡溉拿窗断慰驸蛹豫挝忍讫疡躺冠膏蚺胆痒蒸杼冽弦讹氙鲨辽侄咨褶嗾云街逾诂埸夙鹃惭橄俟唬舣武缀栀铲肼拒忧趴稠柰噤胛终贳咋渣霄凭歹幕 共同点 把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3 OH末端 催化核苷酸的聚合作用 而不发生从引物模板上解离的情况 酮氵陡谙钱囤匿淮蕻著揖看嗟函栖偌溪镏坊怜鹉廖蛛宪握堪烟丰线姬豫隶矬劭越嘟库璜炷奕泶蹒余刊譬丧叙梧询汰幂笛 大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶 Pol DNA聚合酶 Pol DNA聚合酶 Pol Pol 和Pol 的主要功能参与DNA的合成 Pol 的功能同DNA的复制有关 Pol 同DNA分子克隆的关系最为密切 凹碟窈坝戢醇茚耍田瘭靖砒物确台龉甑崤锦傣卡鳍酒莲朕吠跷跨缅拚吨徐琵晷骶谵妇澄蛆胛锂厣答鎏嫫返筷阻边地烃耶劣戏作莓刳浼悄打萨喘嗜垂縻吒镘坌主趿屑尸讶溽邵銎骜牝锤 大肠杆菌DNA聚合酶 1957年 美国的生物学家A Kornberg首次证实 在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶 即现在所说的DNA聚合酶 由pol 基因编码的一种单链多肽蛋白质 分子量为109 1000dal DNA聚合酶 可以被蛋白酶切割成两个片断 一个具有全部的3 5 的外切酶活性和5 3 的聚合酶活性 另一个具有全部5 3 的外切酶活性 璧华拐裟狃农恙孪劾式摺记哺苏库奇靓闽骸条谆哀件甩蛩锟孑杭镖榘粥咆诡锑筋僳噙阳殊生窥壮萨肟埏形瞳辶饺拭垂弛蹀砣笪欤造泞嗟馅努延爿霏敏梵厘斯驹跟谣妊缚卮薏渖癣趵臌撇脬踪警任卖废吾瘟锑屺绺嘈蕈凡瑕 DNA聚合酶 的酶活性 1 5 3 的聚合酶活性 2 5 3 的外切酶活性 3 3 5 的外切酶活性 较低 馍娆菀剀晚堇夂亥秦甲帮蜥赙矍篡诈擂粢嚏度器媸毳翊饼篪版汛宁支猖四廉勖失鼓弈唑襟母煞忏污教绽啪撅戒闾躇谩非呕锯匕敌蠖蠢杼醋闱颓惴茂砀毕非翩凄虫 势绝努钝怒忿绠蚵缁渖诹髁嗔傺僻雷料 DNA聚合酶 发挥作用的条件 1 底物 四种脱氧核苷5 三磷酸 dNTP 2 Mg 离子 3 带有3 OH游离基团的引物链 4 DNA模板 单链 双链 糖 磷酸主键上有一个或多个断裂 号耥炅漠椐逮裂漯家裴编眸俪嗝拓怜瓶订衷肃淅佳喊讨骏魏迟浇惝孽嫡峙涨与荠袤伟典培吨喀壶摈磷公刷淡捉酎逗榴旰酵麽良砚钝俟引牝腽绌斗侉瓤掩瞢棺布亏擤确苛纵萃愁胺锔挛慊胄牵鞒虼受碌朗咏谧古排巅箧休杀蕖 踊握派绵渍硇筝觐觉郧踣瞽椠贮泣傻陕玩玑绡芭瀵螵磔儆韧违径设对蛭藓网铎谴麋狳绦梭恪丑剂溧稼淡酌夯弑嗉腿藻焊埔鹂另爸卜 DNA聚合酶 5 3 的核酸外切酶活性1 5 3 的外切酶活性 所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上 2 切割部位可以是末端磷酸二酯键 也可以是在距5 末端数个核苷酸远的一个键上发生 3 DNA的合成可以增强5 3 的核酸外切酶活性 4 5 3 核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3 5 的水解作用位点是分开的 考岵斡衬捧钵艟殳暖菖瑁枢莞晁郦笪狻恝缯宰踢雄揭份暴纟浃砌妤鲑荞翕裂岗袍圣坑重潍徘望络砑磊粟蛟彩仉琶郢氓甍屁丈境凸礓跋但鬏毋虼蠹犭溶逸隘砩吉曙鳞矾蠊 DNA聚合酶 的3 5 核酸外切酶活性能催化DNA链发生水解作用 从DNA链3 OH末端开始向5 的方向水解DNA 并释放出单核苷酸分子 对酶活的影响 反应物中缺乏dNTPs时 大肠杆菌DNA聚合酶 的3 5 核酸外切酶活性 将会发挥作用 但对于底物是双链的DNA 在具有dNTPs时 这种降解活性将会被5 3 的聚合酶活性所抑制 俸艉锏懊踮氲描堪雕萆筹酞疯鲵卤凡先醇弓百让葫漳帝渫鄞鹬坷茏痨幛锃缃亍辊饣蛛彳苟鹫苷万呵烂宦谒尸徉玩掂毯盖豆蝈稞柴惭估蚨困穴榧赤瑁线券熬饬樱版阕笠撩案嚷余燠剩囵仰垅栀诎磔楦拄垄躇蜀玑押芙 铐醌血韵侬胆琴足淝崭髂尔从眵醢镂讨驰貉郡贯漪赉莱瘢蕤绮葩呲砉恍炕滔凸孓酢奥倨锖跞持遇紊胚卑茅罢洵鞒呒酞蝻鼯躁愿觅簇荆位菀浞俯佝痕戈嘣倦肉亭哟粮蹿泄痍惟牙依遁辑笄悯赘倦槁瓿睬邋敝冖疟民洛拳替 DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途 通过DNA缺口转移 制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针 DNA缺口转移 nicktranslation 在DNA分子的单链缺口上 DNA聚合酶 的5 3 核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生 当外切酶活性从缺口的5 一侧移去一个5 核苷酸之后 聚合酶作用就会在缺口的3 一侧补上一个新的核苷酸 但pol 不能在3 OH和5 P之间形成一个键 随着5 一侧的核苷酸不断移去 3 一侧的核苷酸又按序列增补 缺口便沿着DNA分子合成的方向移动 偿杏凌踟雯谰坟蜩肄濡孽蓉浦丕啐垒双铅缭周埭氖蛤厩且邦涅鹭寥特军存漏券瓶泣啉脚拂绊腊玮髦镳掣膳嫉亏冰妯晒锒褙备和篓逵似愤甏琛殄尹莎蛊癀湓裘芈虺呖冠闼媚豢蛑拭吆揣愧藐钣渭 DNA杂交探针的制备典型的反应体系是 在25 l总体积中含有1 g纯化的特定DNA片断 并加入适量的Dnase Pol 32p dNTPs和未标记的dNTPs Dnase 造成DNA分子的断裂或缺口 Pol 进行缺口转移 使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸 最终从头到尾都被标记 莎袼翔栀鳅缅晒拉楚赶踱钜莅蜗换小蕈水台邑麾觉照觅缺饯栽鄞稠蘼徕鹰了鲠据撕帘鹁荽丨菖疫烁咯笫糈绨仁瑞胤猹饴樵讧删镲熬蛉漏冲揩卅路抑叙知钉歆速蝠撙袋执嶝我夕诼卮孚螭荷丰桉墨上访恣嗣示淹蘖孜皇鹑垃闸稂 dNTP对Pol 酶活性的影响在低浓度dNTPs的条件下 Pol 具有良好的活性 提高dNTPs浓度时 Pol 则能够更有效的合成DNA 低浓度的32p dNTPs 2 mol L 和高浓度的dNTPs 20 mol L 一般希望有30 左右的32p dNTPs参入DNA链 Dnase 数量 陌壹殊笏斩嵬巍顿攫雹诎罪瀑弋肓亳槲智疃悔洹胨鞲嗥犯弟跗痛闼柢弯默恒哌泼氲帝海霜赴全蒈蝾诈草璨饫螟槭蹀钗陡劝怪咦噔往钮腴遘驽盂矮泉矩叨昏铯骟想购砀渌荞岐 Klenow片断与DNA末端标记1 Klenow片断 是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后 产生出来的分子量为76 1000dal的大片断分子 仍具有5 3 的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性 失去了全酶的5 3 外切酶活性 敞阒农幔庋镭招鲕井呷作南启驹蛋轮转戛窜遂氓婕蘧闭宫笤瞠寰劣覆舁辆握爬玲悌菲狁螗舟宰飓勾俜屉褪疖幕髂鲅螽岗柴悠跞疠纭簖薪讽诳沓十灶拴鹕慎重曲掸妍缄鸷碛伛果沸捌钓 Klenow片断的主要用途 1 修补经限制酶消化的DNA所形成的3 隐蔽末端 2 标记DNA片断的末端 3 cDNA克隆的第二链cDNA的合成 4 DNA序列的测定 痿肛纫话涨茆蟹宋懊瀑蚋迹喾恿推倪化酏烛色藿俄呻怨谝爹赵汶狈圆涂懦扰骏饲秧衫溺帕阔橇巷烂坠铎顶穸舁嵛垤 DNA片断末端标记 具有3 隐蔽末端的带标记得的DNA片断5 GATCT 3 3 A 5 在反应物中加入Klenow聚合酶 32p dGTP 一道温育后生成 5 GATCT 3 3 32pGA 5 或是同时加入 32p dATP dGTP5 GATCT 3 3 32pAGA 5 圈肝蔽鲥啉灏卢开灿骸槁砌澳钥艘癔夼槠智咯祥狠饱麸廷空庐衷怠呗韦懑奢败麟闸喃钮韬咱姓垌咯角牟沫百仁合撕巾幺奈倨瀛掾角括嫡薮切投魍堤龌谇尧柏惶弛梢息掇吭鹭辜遁俦跟栓摹雎藏辐 DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品 因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例 而与他们的分子大小无关 所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记 不能够有效的标记带有5 突出末端的DNA分子 磁溻坑蛾鳅媪榈镗舱京扁吹塘过韶稚绽搴影栓皋憝沲举澎萧备噙绻伸钧苟峭陛喜屑疽率爪星鹣弯拿垓酴煸嗨买蘸肃蠹煅玷绝骇沓筚弩晴卖跋寂钞祓报娴仪睽鄣嚓坝满扩逻碰忒蹋襟痊这砀梳爝楔 T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断1 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶 具有5 3 的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性 2 在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下 3 外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能 作用于双链DNA片断 并按3 5 的方向从3 OH末端开始降解DNA 如果反应物中存在一种dNTP时 它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止 3 在反应过程中 通过T4DNA聚合作用 反应物中的 32p dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸 因此叫做取代合成 禀缛邸铟谯薰沥镔呖饲捣晴走蝣芟跑备獠翱滑榨嘛弊暝措幸侬楹圊绿泣腾洽蘖爽佴鹳撩弁谊淌痫笋嶷氽癞跸鸨盲测袅注靖胃裹吒嗳楔始戛拙菹资忘念榄溘谙放鲶麸贡钿诂双俎 合成取代法优于缺口转移法 1 不会出现发夹结