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微生物基本试验原理及操作 微生物基本试验 碳源和氮源利用试验碳水化合物的代谢试验各种酶类试验氨基酸和蛋白质代谢试验 碳源和氮源利用试验 柠檬酸盐试验葡萄糖酸盐试验 柠檬酸盐试验 原理 有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源 分解柠檬酸钠生成碳酸钠 使培养基呈碱性 能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌 也能利用铵盐作为唯一氮源 铵盐被分解为氨而产生碱性 西蒙氏柠檬酸盐培养基成分 MgSO4 7H2O0 2gNH4H2PO41gK2HPO41g柠檬酸钠5g氯化钠5g琼脂20g0 2 溴麝香草酚蓝溶液40ml蒸馏水1000ml 结果 阳性者表面上长有菌落 培养基变为蓝色 葡萄糖酸盐试验 原理 检查细菌是否具有氧化葡萄糖作为唯一碳源 并具有还原2 酮基葡萄糖酸盐与班氏试剂混合加热生成黄红色酮类的能力 方法 接种大量待检菌于培养基内 35 24 48小时 0 5ml培养基加班氏试剂3滴左右 加热煮沸后观察结果 葡萄糖酸盐蛋白胨肉汤成分 蛋白胨0 15g酵母浸膏0 1g磷酸二氢钾0 1g葡萄糖酸钾 或钠 4g蒸馏水100ml 结果 出现黄色到橙红色沉淀为阳性 无颜色变化为阴性 碳水化合物的代谢试验 氧化 发酵试验 OF试验 糖醇发酵试验B 半乳糖苷酶试验 ONPG试验 甲基红试验VP试验胆汁七叶苷试验 氧化 发酵试验 OF试验 原理 细菌在分解葡萄糖的过程中 必须有分子氧参加的称为氧化型 在无氧条件下降解葡萄糖的称为发酵型 不分解葡萄糖的细菌称为产碱型 利用此试验可以区别细菌的代谢类型 Hugh Leifson二氏培养基 O F培养基 成分 蛋白胨2g磷酸氢2钾0 3克氯化钠5g葡萄糖10g0 2 溴麝香酚蓝溶液12ml琼脂2 5g蒸馏水1000ml 方法 将待检菌接种于二支Hugh Leifson培养基的试管中 均用接种针穿至管底 其中五支加入灭菌的液体石蜡约1厘米厚 35 培养48小时观察结果 培养基颜色变黄即为产酸 结果 代谢类型加蜡封口管开放管发酵型产酸产酸氧化型不变色产酸产碱型不变色不变色 糖醇发酵试验 原理 各种细菌因含有发酵不同糖 醇类的酶 所以分解糖 醇类的能力各不相同 分解糖 醇类后产生的代谢产物可因菌种不同而异 有的产酸 产气 有的仅产酸 故用于鉴别细菌 糖 醇类试验培养基成分 蛋白胨水或肉膏汤100ml所需的糖 醇或苷类0 5或1g1 6 溴甲酚紫乙醇溶液0 1ml 结果 接种的细菌 若能耐分解培养基中的糖类产酸时 则使培养基中的指示剂呈酸性反应 若产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒管内出现气泡 若不分解则无变化 B 半乳糖苷酶试验 ONPG试验 原理 有的细菌可产生B 半乳糖苷酶 此酶可分解邻 硝基酚 B D 半乳糖苷 ONPG ONPG为无色 经B 半乳糖苷酶水解后 可产生黄色的邻硝基酚 即使浓度很低也能检出 结果 呈现黄色为阳性反应 迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性 本试验可作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法 甲基红试验 原理 某些细菌在糖代谢过程中 分解葡萄糖产生丙酮酸 丙酮酸可进一步被分解为甲酸 乙酸 乳酸等 而使培养基的pH下降至4 5以下 加入甲基红指示剂出现红色 阳性 甲基红试验 原理 有些细菌分解葡萄糖产酸量少 或产生的酸进一步转化为其它物质 如醇 酮 醛 气体和水 则培养基的酸碱度仍在6 2以上 故加入甲基红指示剂呈黄色 阴性 葡萄糖蛋白胨水培养基成分 多价蛋白胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾5g蒸馏水1000ml 方法 被检菌接种于上述培养基内 于35 培养48小时 于2ml培养液内加甲基红指示剂2滴 立即观察结果 结果 红色为阳性 桔红色为弱阳性 黄色为阴性 VP试验 原理 有些细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸 丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇 乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧化为二乙酰 丁二酮 进而与培养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍基发生反应 生成红色化合物 即VP反应阳性 培养基中的胍基太少时 加入少量含胍基的化合物 如肌酸或肌酸酐等 可加速此反应 试剂 甲液 6 a 萘酚乙醇溶液乙液 40 氢氧化钾溶液 方法 将被检菌接种葡萄糖蛋白胨水培养基后 于35培养48小时 于2ml培养基内加入甲液1ml和乙液0 4ml 振摇后观察结果 结果 于数分钟内呈红色为阳性 如无红色出现 而且于35 中4小时后仍如故者即为阴性 本试验较为敏感 胆汁七叶苷试验 原理 在10 14 胆汁存在下 测定细菌水解葡萄糖苷七叶苷为七叶亭和葡萄糖的能力 胆汁七叶苷培养基成分 蛋白胨5g牛肉浸膏3g牛胆汁 胆汁 40g七叶苷1g柠檬酸铁0 5g琼脂15g蒸馏水1000ml 结果 培养基变为黑色或深褐色为阳性 有生长物时 并不表示七叶苷裂解 仅表示胆汁浓度不能抑制D群链球菌外的细菌生长 各种酶类试验 过氧化氢酶 触酶 试验氧化酶试验血浆凝固酶试验硝酸盐还原试验胆汁溶解试验环腺苷酸 cAMP 试验 过氧化氢酶 触酶 试验 原理 有些细菌具有过氧化氢酶 能将过氧化氢酶分解为水 试剂 3 过氧化氢溶液 方法 玻片法 用牙签挑取18 24小时培养的菌苔 置于洁净的玻片上 滴加3 过氧化氢溶液1 2滴 试管法 取不含血液的18 24小时培养物一接种环于试管内 加入1ml3 过氧化氢溶液 3 过氧化氢溶液应置于棕色瓶内冷藏 结果 产生大量气泡为阳性 不产生气泡为阴性 血浆凝固酶试验 原理 凝固酶能凝固血浆纤维蛋白 是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验 本试验分玻片法和试管法 玻片法主要是检测结合凝固酶 试管法是为了肯定玻片法试验结果和对玻片法试验阴性者进行复查 检测游离凝固酶 血浆凝固酶试验 原理 结合凝固酶为金黄色葡萄球菌细胞表面含有 游离凝固酶为金黄色葡萄球菌产生的一种胞外酶 两酶均可作用于血浆中的纤维蛋白原 使其转变为纤维蛋白 形成凝块 方法 玻片法 在玻片上加一滴灭菌生理盐水 取葡萄球菌18 24小时肉汤培养物一环 或挑取平板上一个单个菌落制成浓菌悬液 再加一接种环新鲜人或兔血浆与菌悬液混匀 同时做阳性菌和阴性菌对照试验 立刻观察凝块的形成 本试验应先在生理盐水中乳化 检查有否自凝现象 防止出现假阳性结果 阳性结果一般在5 20秒内出现 若3 4分钟后仍无凝固 可考虑为玻片法试验阴性 试管法 将洁净小试管中加0 5ml未稀释的人或兔血浆 加0 5ml培养18 24小时的葡萄球菌肉汤培养物一满环 或挑取平板上的纯菌落 轻轻转动 不要摇动 试管混匀 放35水浴中4小时 每隔30分钟检查一次有无凝固 检查时不要振动或摇动试管 可轻轻将试管倾斜以观察有无凝块 大多数金黄色葡萄球株在35 4小时可以凝固血浆 如果阴性对照 枸椽酸盐抗凝的血浆可产生假阳性结果 氧化酶试验 原理 某些细菌具有氧化酶 在有氧和细胞色素C时 使还原型细胞色素C氧化 氧化型细胞色素C再使二甲基对苯二胺氧化 产生玫瑰红至暗紫色 有时菌落本身带有红色 不易观察 可再加入a 萘酚乙醇溶液 使生成深蓝色的靛酚蓝 试剂 1 1 盐酸二甲基对苯二胺 或四甲对苯二胺 水溶液2 1 a 萘酚95 乙醇溶液 方法 取18 28小时的新鲜培养物 用无菌滤纸条 蘸取菌落少许 滴加1 盐酸二甲基对苯二胺1 2滴 观察结果 结果 一分钟内出现紫红色为阳性 若菌落本身有色素 则再滴加a 奈酚1 2滴 出现蓝色则为阳性 硝酸盐还原试验 原理 硝酸盐还原反应有两个过程 其一是硝酸盐还原为亚硝酸盐 其二是继续将亚硝酸盐进一步分解为氨 氮 氧化氮等气体终末产物 硝酸盐还原试验培养基成分 蛋白胨1g硝酸钾0 1g蒸馏水100ml 方法 将待检菌接种于硝酸盐培养基中 35 培养1 4天 将甲 乙试剂各加0 1ml于试管内 混匀观察结果 结果 出现红色为阳性 如无红色出现 应加少量锌粉 如仍无红色说明亚硝酸盐进一步分解成氮 氨等气体 应判为阳性 如加锌粉出现红色 说明还原剂锌粉使硝酸盐还原为亚硝酸盐 待检菌无还原硝酸盐的能力 为阴性 胆汁溶解试验 原理 在特定时间和温度条件下测定胆盐溶解细菌的能力 溶菌的机理尚未定论 有人认为胆盐或胆汁能激活肺炎链球菌的自溶酶 使菌体发生溶解 试剂 10 去氧胆酸钠溶液或牛胆汁 平板法 10 去氧胆酸钠溶液一接种环 加于血琼脂平板的试验菌落上 置于35孵育30分钟 肺炎链球菌菌落消失为阳性 阴性者菌落仍存在 环腺苷酸 cAMP 试验 原理 B群链球菌 无乳链球菌 能产生一种因子 cAMP因子 这种因子在绵羊血或牛血培养基上与金黄色葡萄球菌 溶血素起协同作用 促进 溶血素的活性 因此在两种细菌的交界处溶血力增加 出现箭头形溶血区 方法 首先在羊血平板上接种一长条金黄色葡萄球菌 药敏质控菌 再将被检菌与金黄色葡萄球菌接种线垂直接种一短条 两者不能相交 应相距3mm左右 同时在被检菌接种线对侧 用同样方法接种阴性和对照菌 35 培养过夜 如放在CO2烛缸内结果更为好看 金黄色葡萄球菌用ATCC25923为佳 结果 在被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线处出现一个矢状加强溶血区 为CAMP阳性 阴性无加强溶血区 氨基酸和蛋白质代谢试验 吲哚试验硫化氢试验苯丙氨酸脱氨酶试验氨基酸脱羧酶试验 赖氨酸 鸟氨酸 精氨酸 脲酶试验明胶液化试验 吲哚试验 原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸 生成吲哚 靛基质 经与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用 生成玫瑰吲哚而呈红色 蛋白胨水培养基成分 蛋白胨 或胰胨 10 20g氯化钠5g蒸馏水1000ml kovac氏试剂对二甲氨基苯甲醛10g纯戊醇150ml纯浓盐酸50ml先将试剂溶于醇中 缓慢加入盐酸即成 方法 挑取纯培养物接种蛋白胨水培养基 于35 培养1 2天 沿管壁徐徐加入kovac氏试剂0 5ml 使成两层 观察结果 结果 在两者液面交界处出现红色为阳性 无色为阴性 硫化氢试验 原理 细菌分解培养基中的含硫氨基酸 如胱氨酸 半胱氨酸 和含硫化物生成硫化氢 硫化氢遇铅或铁离子生成黑色的硫化物 由此间接地检测细菌是否产生硫化氢 培养基 三糖铁培养基或克氏双糖铁培养基 结果 培养基黑为阳性 无变化为阴性 苯丙氨酸脱氨酶试验 原理 细菌产生苯丙氨酸脱氨酶 能使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸 苯丙酮酸与铁离子作用生成绿色络合物 苯丙氨酸培养基成分 DL苯丙氨酸0 2g L苯丙氨酸0 1g 酵母浸膏0 3g氯化钠0 5g磷酸氢二钠0 1g琼脂1 2g蒸馏水100ml 试剂 10 三氯化铁溶液 将10克三氯化铁溶于100ml蒸馏水中即成 方法 将待检菌接种于培养基斜面上 35培养24小时 滴加三氯化铁试剂 观察结果 结果 培养基斜面上显绿色为阳性 不变色为阴性 氨基酸脱羧酶试验 赖氨酸 鸟氨酸 精氨酸 原理 检查细菌使氨基酸脱去羧基 生成胺类化合物 使培养基变碱的能力 氨基酸脱羧酶基础培养基成分 蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g6 溴甲酚紫洒精溶液1ml蒸馏水1000ml将上述成分溶于蒸馏水 然后加进所需氨基酸 赖氨酸 鸟氨酸 精氨酸 使其浓度为 对照管不加氨基酸 方法 取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中 封灭菌液体石蜡 35培养24小时以上观察结果 注意事项 培养基pH应偏酸 有利于酶的形成 加封液体石蜡造成厌氧环境 在厌氧环境下氨基酸脱羧生成的胺才稳定 另外也可避免出现假阳性 如对照管不变色则不能判断结果 结果 接种待检菌的测定的培养基是紫色 对照管是黄色为阳性 两管均是黄色为阴性 脲酶试验 原理 某些细菌能产生脲酶 脲酶可分解尿素 尿素经分解后产生大量的氨 使培养基变碱 尿素培养基成分 蛋白胨1g氯化钠5g葡萄糖1gKH2PO42g20 尿素水溶液100ml琼脂15g0 1 酚红水溶液12ml蒸馏水900ml 方法 将被检菌接种于尿素培养基后 置35 培养18 24小时观察结果 阴性应观察4天 结果 细菌分解尿素后培养基变红为阳性 不变为阴性 明胶液化试验 原理 明胶酶是细菌产生的一种胞外酶 能分解明胶为氨基酸 从而失去凝固力 使半固体的明胶培养基成为液体 明胶培养基制法 于普通琼脂中加入1 明胶即成 方法 将被检菌穿刺接种于明胶培养基 于20培养7天 逐日观察明胶液化现