蛋白氮与非蛋白氮区分检测规程

精品文档 1欢迎下载 蛋白氮与非蛋白氮区分检测规程 A 非蛋白氮的概述 非蛋白氮大致可以分为以下几类 尿素及其衍生物类 如缩二脲 羟甲基尿素等 氨 态氮类 如液氨 氨水等 铵类 如硫酸铵 氯化铵等 肽类及其衍生物 包括氨基 酸 酰胺 胺等 动物粪便及其它废弃物类 以下是几种常见的非蛋白氮的介绍 双缩脲 又称缩二脲 是一种尿素缩合产品 其含氮量在 35 上 蛋白质当量为 219 缩二脲难 溶于水 一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法 原理 鱼粉中的双缩脲经抽提 后 在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物 在 550nm 波长下比色从而 测出其含量 尿素 是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成 纯尿素的含氮量为 47 折合蛋白当量为 293 75 易潮解 易溶于水 一般的定量检验方法有二种 一种为二甲基氨基苯甲醛显 色法 另一种为二嗪衍生物显色法 但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍 生物 尿素甲醛聚合物 是由尿素和甲醛聚合而成 其含氮量为 38 89 折合蛋白当量为 243 06 该聚合物难 溶于水 硫酸铵 俗称肥田粉 其含氮量为 20 左右 折合蛋白当量为 125 硫酸铵的工业品一般为白色 或微带黄色的结晶 易溶于水 其分子式为 NH 4 2 SO 4 异亚丁基二脲 又名二脲异丁烷 简称 IBDU 为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成 IBDU 为一 种子的白色粉末或颗粒 总含氮量为 32 18 折合蛋白当量为 201 13 吸湿度远低于 尿素 以上是比较常见的非蛋白氮物质 随着科技的发展 还会有越来越多的非蛋白氮物质被合 成出来 从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛 而掺假者很容易将此物质掺入饲料原 料中以提高原料的粗蛋白质 B 非蛋白氮的检验 1 非蛋白氮的定性检验 在对原料样品的检测中 一般有定性检测和定量检测 在定性检测中 使用的比较多的为 显微镜检 包括直接镜检 分层镜检 用四氯化碳或三氯甲烷分层 反应剂镜检 用化学 物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分 染色镜检等 在使用的过程中 往往使用 一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定 对于非蛋白氮的检验 显微镜检是一种比较有效的方法 在对样品的检测中 一般使用的 是生物显微镜 其放大的倍数在 36 400 倍之间 为了获得更好的显微效果 可以根据实 际情况作出具体的调整 以下是镜检使用过程中的一些技巧 直接镜检 直接镜检一般所用的倍数比较小 通过对样品不同的物理特征 如颜色 透明度 表面组 织 形状等物理性状进行判定 特别的要与典型的样品进行比较 以便能够更好区分样品 与杂质的不同 在直接镜检中 用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果 虽然直接 镜检比较方便和直观 但有时对于样品中的物质很难区分时 可以用其它的检验方法 分层镜检 精品文档 2欢迎下载 将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后 样品与其它物质的区分会更加容易 对样品 中的有机物和无机物分层之后 需在常温下干燥后再进行镜检 非蛋白氮一类的物质与原 料的很多外观性质很不一样 通过两者的特异性之间的观察 可以对样品中是否掺有非蛋 白氮一类的物质作出一个大概的判断 反应剂镜检 用反应剂和样品进行反应 非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样 通过此种方法 可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别 经过四氯化碳分层之后 再与反应剂反应是比较好的 一种方法 而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸 观察样品与浓硫酸反应的情况是一种 比较直观的鉴别方法 因为无论动物蛋白还是植物蛋白 其与浓硫酸的反应速度和产生的 现象比较明显 染色镜检 用染色剂对样品进行染色 使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色 而非蛋白氮一类 的物质则和样品的染色后的表现不同 通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别 以下 是比较常用的染色方法 对植物细胞的染色方法 番红 固绿染色法 取适量脱胎 视样品脂肪多少而定 可以 用四氯化碳 也可以用丙酮 对于脂肪少的也可以不用脱脂 样品于烧杯中 用 1 的番 红水溶液浸泡 l 3h 水洗 去多余的染料 将样品涂在玻片上 稍晾干 滴加 0 l 的 固绿 溶剂用 95 乙醇 过 15s 后滴加 95 的乙醇 冲去多余固绿染料 待乙醇稍挥 发后 加甘油液 甘油 水 1 1 浸润 加盖玻片 用生物显微镜检查 染色结果 细胞 核 木质化细胞壁呈鲜红色 纤维素细胞壁 细胞质呈绿色 因为非蛋白氮没有细胞核 细胞质等结构 所以只要能够较好的掌握染色技巧 其对比效果比较明显 当然 不能从 染色效果判断其一定为非蛋白氮 对动物细胞的染色方法 苏木精 曙红对染法 取适量的脱脂样品于烧杯中 加入埃利 希苏木精染色液浸泡 3 5min 水洗数次 用 5min 左右 将样品涂在玻片上 滴加氨水 3 4s 后立即满加水 洗 l min 稍晾一下 加 0 2 曙红水溶液浸润 3min 滴加 95 的 乙醇 洗去多余曙红染料 再稍晾一下 加甘油浸润 加盖玻片 用生物显微镜观察 其 染色的结果为 细胞核呈蓝色 细胞质呈淡红色 通过此种方法染色 一般能够很容易的 区分样品和非蛋白氮一类的物质 为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质 也可采用以下方法 对于检验鱼粉一类的 物质比较有效 先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层 除去无机物 必要时再用丙酮进 行脱脂 再取一定量的样品置入蒸馏水中 搅拌 除去溶于水的物质 再用 60 目或 80 目 的样品筛过滤 将样品放入 50 60 的烘箱中进行烘干 时间不能过长 以保持样品原来 的状态 然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检 在显微镜检中 只能对非蛋白氮作初步判断 若要进一步的分析判断 还需进行定量分析 检验 2 非蛋白氮定量分析 原理 非蛋白氮主要包括以下五类 尿素及其衍生物类 氨态氮类 铵类 肽类及其衍生物 动 物粪便及其它废弃物类 如果在原料中掺有氨态氮类 铵类和粪便比较容易判断 可采用 硫酸铜沉淀法加镜检 一般很少将肽类及其衍生物掺入其中 剩下比较难鉴别的就是尿素 及其衍生物 尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质 在强碱的 条件下可以蒸馏出氨气 原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐 氨基酸盐在强碱条件下稳 定 从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离 测定结果包括了铵态氮如硫酸铵 精品文档 3欢迎下载 材料与试剂 1 材料 酒精喷灯 60ml 玻璃消化试管 凯氏定氮蒸馏装置 真空泵 200 恒温干燥箱 酸 式滴定管 25ml 锥形瓶 150 或 250ml 容量瓶 100ml 2 试剂与溶液 6mol 1 的盐酸溶液 35 37 分析纯盐酸加等体积蒸馏水 2 硼酸 2g 溶于 100ml 蒸馏水 40 氢氧化钠 分析纯氢氧化钠 40g 溶于 100ml 水 0 05mol l 盐酸标准溶液 邻苯二甲酸氢钾法标定 4 2ml 盐酸 注入 100ml 蒸馏水 中 分析步骤 1 精确称取有代表性肠粘膜蛋白粉样品 0 1000g 置于容积为 60ml 的试管底部 注意 样品勿沾在管壁上 加入 30ml 6mol l 的盐酸溶液 抽真空 将试管在距试管口 l 2cm 处用喷灯加热并封口 将封好的试管置于干燥箱内 于 110 下水解 24h 冷却 后打开试管 将水解液过滤至 100ml 容量瓶中 用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸 然后 定容至刻度 2 用 20ml 移液管移取 20ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中 加入 20ml 1 1 的 氢氧化钠溶液蒸馏 10 min 用加有两滴混合指示剂的 20ml 2 硼酸吸收馏出液 3 用硼酸吸收氨后 立即用 0 05mol l 盐酸标准溶液滴定 溶液由蓝绿色变为灰红色即 为终点 结果计算处理 非蛋白氮的粗蛋白质计算公式 CP V1 V0 C 0 07 6 25 M V1 样品所消耗的盐酸的体积 ml V0 同时作空白滴定消耗的盐酸的体积 M 所称 样品的质量 g C 盐酸标准溶液的摩尔浓度 mol l 注意 从理论上讲 在强酸或强碱和一定的温度 110 的条件下 尿素及其尿素聚合物一定 会水解 但不一定能够在 24h 内水解完全 有人做了大量的试验 证明了缩二脲在 24h 内的水解