中药化学第六章 1

第六章 黄酮类化合物,第一节 概述,黄酮类化合物大多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。黄酮类化合物广泛分布于植物界中，而且生理活性多种多样，引起了国内外的广泛重视，研究进展很快。,一、黄酮类化合物生物合成的基本途径含义：经典定义：主要是指基本母核为2苯基色原 酮类的化合物；现在含义：泛指两个具有酚羟基的苯环（A- 和B-环）通过中央三碳原子互相 连接而成的一系列化合物。,生物合成研究表明A环来自于三个丙二酰辅酶A，B环来自于桂皮酰辅酶A,二、分布,黄酮类主要分布在唇形科、玄参科、爵麻科、苦苣苔科、菊科等黄酮醇广泛分布于双子叶植物二氢黄酮醇普遍存在于豆科植物中异黄酮主要分布在豆科蝶形花亚科和鸢尾科植物中双黄酮多局限分布于裸子植物，如松柏刚、银杏纲和凤尾刚,三、黄酮类化合物的生物活性,1. 对心血管系统的作用Vp样作用：芦丁、橙皮苷等有Vp样作用，能降低血管脆性及异常通透性，促进细胞增生和防止血细胞的凝集，从而可以防治高血压和动脉硬化等,可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。扩冠作用：芦丁、槲皮素、葛根素、人工合成的立可定。降血脂及胆固醇：木犀草素,芦丁是从我国独有的国槐的花蕾中提取的植物药，具有降低毛细血管的异常通透性和脆性的作用，是心脑血管保护药，是国内治疗心脑血管疾病制剂的主要成分，国外还大量用于食品添加剂和化妆品的生产当中。,2. 抗肝脏毒作用从水飞蓟种子中得到的水飞蓟素、异水飞蓟素等黄酮类化合物具有保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤。（+）-儿茶素(Catergen)也具有抗肝脏毒作用，可治疗脂肪肝及因半乳糖胺或四氯化碳等引起的中毒性肝损伤。,3.解痉作用异甘草素、大豆素等解除平滑肌痉挛；大豆苷、葛根黄素等葛根黄酮类可缓解高血压患者的头痛等症状4. 抗菌及抗病毒作用如木犀草素、黄芩苷、黄芩素。,5.止咳祛痰的作用。杜鹃素、川陈皮素、槲皮素、山柰酚、芫花素、羟基芫花素等还具有止咳祛痰的作用。6.清除人体自由基作用黄酮类化合物多具有酚羟基，易氧化成醌类而提供氢离子，故有显著的抗氧特点。另外还有降血脂、血糖，抗动脉粥样硬化及抗癌、抗突变等作用。,7. 雌性激素样作用大豆素(daidzein)等异黄酮具有雌性激素样作用，可能是因为它们与己烯雌酚结构类似。,分类依据根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置（ 2-或3-位）以及三碳链是否构成环状等特点，可将重要的天然黄酮类化合物分类如下：,第二节 黄酮类化合物的结构与分类,一、黄酮类黄酮类是以2-苯基色原酮为基本母核，3位无含氧取代的一类化合物。天然黄酮A环的5，7位几乎同时带有羟基，而B环常在4位有羟基或甲氧基，3位有时也有羟基或甲氧基。,黄酮类(flavones),常见的黄酮及其苷类有芹菜素、木犀草素、黄芩苷等。,芹菜素,木犀草素,黄芩苷,二、黄酮醇类黄酮醇类在黄酮基本母核的3位上连有羟基或其他含氧基团。,黄酮醇(flavonol),常见的黄酮醇及其苷类有山柰酚、槲皮素、杨梅素、芦丁等。,山柰酚,杨梅素,槲皮素 R=H芦丁 R=芸香糖,三、二氢黄酮类二氢黄酮类结构可看作是黄酮基本母核的2、3位双键被氢化而成。,二氢黄酮类（Flavanones）,如橙皮中的橙皮素和橙皮苷；甘草中的甘草素和甘草苷。,橙皮素 R=H橙皮苷 R=芸香糖,甘草素 R=H甘草苷 R=glc,四、二氢黄酮醇类二氢黄酮醇是黄酮醇类的2、3位被氢化的黄酮类化合物，而且常与相应的黄酮醇共存于同一植物中。,二氢黄酮醇类 （Flavanonols）,如满山红叶中的二氢槲皮素和槲皮素共存，桑枝中的二氢桑色素和桑色素共存。,二氢槲皮素,二氢桑色素,黄柏叶中具有抗癌活性的黄柏素-7-O-葡萄糖苷也属于二氢黄酮醇类。,黄柏素-7-O-葡萄糖苷,五、异黄酮类异黄酮类母核为3-苯基色原酮的结构，即B环连接在C环的3位上。,异黄酮类（Isoflavanone）,豆科植物葛根中所含有的大豆素、大豆苷、大豆素-7，4-二葡萄糖苷、葛根素和葛根素木糖苷均属于异黄酮类化合物。,大豆素 R1=R2=R3=H大豆苷 R1=R3=H R2=glc葛根素 R2=R3=H R1=glc大豆素-7，4-二葡萄糖苷 R1=H R2=R3=glc葛根素木糖苷 R1=glc R2=xyl R3=H,六、二氢异黄酮类二氢异黄酮具有异黄酮的2、3位被氢化的基本母核。,二氢异黄酮类（Isoflavanones）,如中药广豆根当中含有的紫檀素、三叶豆紫檀苷、高丽槐素具有抗癌活性，苷的活性强于苷元。毛鱼藤中所含有的鱼藤酮也属于二氢异黄酮的衍生物，具有较强的杀虫和毒鱼作用。它们都属于二氢异黄酮类的衍生物。,紫檀素 R=CH3三叶豆紫檀苷 R=glc高丽槐素 R=H,鱼藤酮,七、查耳酮结构特点为二氢黄酮C环的1、2位键断裂生成的开环衍生物，即三碳链不构成环。,查耳酮类（Chalcones）,在酸的作用下，查耳酮可转化为无色的二氢黄酮，碱化后又转为深黄色的2-羟基查耳酮。,2-羟基查耳酮,二氢黄酮,如红花的花中含有的红花苷,红花苷,红花所含的色素红花苷是第一个发现的查耳酮类植物成分。 红花在开花初期，花冠呈淡黄色；开花中期，花冠呈深色；开花后期或采收干燥过程中由于酶的作用，氧化成红色。,八、二氢查耳酮类二氢查耳酮为查耳酮、双键氢化而成。,二氢查耳酮类（Dihydrochalcones）,二氢查耳酮在植物界分布极少，如蔷薇科梨属植物根皮和苹果种仁中含有的梨根苷。,梨根苷,九、橙酮类（噢口弄类）结构特点为C环为含氧五元环。母核碳原子的编号也与其他黄酮类不同。,橙酮类,此类化合物较少见，主要存在于玄参科、菊科、苦苣苔科以及单子叶植物沙草科中，如在黄花波斯菊花中含有的硫磺菊素属于此类。,硫磺菊素,十、花色素类结构特点是基本母核的C环无羰基，1位氧原子以（金羊）盐形式存在。,花色素类（Anthocyanidins）,花色素在中药中多以苷的形式存在。花色素是使植物的花、果、叶、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的色素，如矢车菊苷元、飞燕草苷元和天竺葵苷元以及它们所组成的苷最为常见。,矢车菊苷元 R1=OH R2=H飞燕草苷元 R1=R2=OH天竺葵苷元 R1=R2=H,十一、黄烷醇类根据C环上的3，4位存在羟基的情况分为黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二醇。1.黄烷-3-醇类，又称儿茶素类,黄烷-3-醇类（Flavan-3-ols）,主要存在于含鞣质的木本植物中。如儿茶素为中药儿茶中的主要成分，有四个光学异构体，但在植物中主要有异构体两个，儿茶素和表儿茶素。,儿茶素,表儿茶素,2.黄烷-3，4-二醇类又称为无色花色素类，,黄烷-3，4-二醇类（Flavan-3,4-diols),这类化合物在植物界中分布很广，在含鞣质的木本植物和蕨类植物中更为多见，如：无色矢车菊素。,无色矢车菊素,十二、双黄酮类双黄酮类是由二分子黄酮衍生物聚合而成的二聚物,十三、其他黄酮类苯骈色原酮，母核由苯环和色原酮的2，3位骈合而成，是一种特殊类型的黄酮类化合物。,常分布在龙胆科、藤黄科、百合科植物当中，如：存在于石苇、芒果叶和知母叶中具有止咳去痰作用的异芒果素。,异芒果素,榕碱,水飞蓟素,黄酮木脂体类，生物碱型黄酮等。,天然黄酮类化合物多和糖形成苷而存在，并且由于糖的种类、数量、连接位置及连接方式不同，组成了各种各样的黄酮苷类。,组成黄酮苷的糖类主要有单糖、双糖类、三糖类和酰化糖类。单糖类： D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。双糖类： 槐糖（glc 12 glc）、龙胆二糖(glc 16 glc)、芸香糖(rha 16 glc)、新橙皮糖（rha12 glc）、刺槐二糖（rha 16 gal）等。,三糖类： 龙胆三糖(glc 16 glc 12 fru)、槐三糖(glc 12 glc 12 glc)等。 酰化糖类： 2-乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖(caffeoylglucose)等。,黄酮苷中糖的连接位置与苷元的结构类型有关。如黄酮醇类常形成3-， 7-， 3- ， 4 -单糖苷，或3,7-，3,4-及7,4-双糖链苷等。,除氧苷外，天然黄酮类化合物中还发现有C-键苷，如：葛根黄素木糖苷。和葛根素共同构成了中药葛根扩张冠状动脉的有效成分。,葛根黄素木糖苷,第三节黄酮类化合物的理化性质,一、性状1、形态黄酮类化合物多为晶状固体，黄酮苷类多为无定形粉末。,2、颜色黄酮的色原酮部分无色，在2-位上引入苯环后，即形成交叉共轭体系，使共轭链延长，因而呈现出颜色。,黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄黄色，查耳酮为黄橙黄色，异黄酮类显微黄色，二氢黄酮、二氢黄酮醇不显色。,花色素及其苷元的颜色随pH不同而改变，一般显红色( pH 7 )、紫色( pH8.5 )、蓝色( pH8.5 )等颜色。,在上述黄酮、黄酮醇分子中，尤其在7-位及4-位引入OH及OCH3等供电基（助色团）后，通过电子转移、重排使化合物的颜色加深，但在其它位置引入OH、OCH3等供电基影响较小。,二、旋光性：苷元中，二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇具有手性碳，具旋光性，其余黄酮类无旋光性。苷类结构中含糖，故均有旋光性，且多为左旋。,二氢黄酮类（Flavanones）,二氢黄酮醇类（Flavanonols）,黄烷-3，4-二醇类（Flavan-3,4-diols),黄烷三醇类（Flavan-3-ols）,三、溶解性1、游离黄酮类化合物一般来说，游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强的分子，难溶于水;而二氢黄酮及二氢黄酮醇等非平面分子，分子间排列不紧密，分子间引力较低，有利于水分子进入，可溶于水。,花色苷元（花青素）类以离子形式存在，水中溶解度较大。黄酮类苷元分子中羟基数越多，水中的溶解度越大。,2、黄酮苷类 因为引入糖，水溶性比相应苷元为大；糖链越长，则水溶度越大，一般可溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。,四、酸碱性1、酸性黄酮类化合物因分子中多含有游离酚羟基，故显酸性，可溶于碱性溶液中。酸性强弱顺序依次为：7,4-二OH 7-或4 -OH 一般酚OH 5-OH 。此性质可用于提取、分离及鉴定工作。,2、碱性 黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的1-位氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成（金羊）盐，但生成的（金羊）盐不稳定，加水可分解。,五、显色反应（一）还原反应1、盐酸-镁粉（或锌粉）反应：多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红紫红色，少数显紫蓝色，B环有-OH或OCH3取代时，颜色随之加深。查耳酮、橙酮、儿茶素类不显色。异黄酮类一般不显色。,花色素及部分查耳酮、橙酮等在单纯浓盐酸酸性条件下颜色也会发生变化，故须先做空白对照。,NaBH4是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂。与二氢黄酮类化合物产生红紫色。其它黄酮类化合物均不显色。,2、四氢硼钠（钾）反应,特点：二氢黄酮类化合物专属反应,（二）金属盐类试剂的络合反应 1、铝盐：生成的络合物多为黄色（max=415nm），并有荧光，可用于定性及定量分析。常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。,2、锆盐：多用2%二氯氧化锆（ZrOCl2）甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-OH存在时，均可反应生成黄色的锆络合物。注意：加入2%枸橼酸甲醇溶液,黄色不褪有3-OH，或3,5-二OH,黄色褪去有5-OH，没有3-OH,3、镁盐：二氢黄酮、二氢黄酮醇类与醋酸镁的甲醇溶液，加热可显天蓝色荧光，若具有C5-OH，色泽更为明显。而黄酮、黄酮醇及异黄酮类等则显黄橙黄褐色。,在氨性甲醇溶液中，可与分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色棕色乃至黑色沉淀。,4、氯化锶（SrCl2）,特点：检查邻二酚羟基,多数黄酮类化合物因分子中含有游离酚羟基，与三氯化铁水溶液或醇溶液可产生阳性反应，呈现颜色；当含有氢键缔合的酚羟基时，颜色更明显。,5、三氯化铁反应,特点：检查酚羟基,在无机酸或有机酸存在条件下，5-羟基黄酮及6-羟基查耳酮可与硼酸反应，呈亮黄色。在草酸存在下，显黄色并带绿色荧光。在枸橼酸丙酮存在条件下，只显黄色而无荧光。,（三）硼酸显色反应,（四）碱性试剂显色反应在日光及紫外光下，通过纸斑反应，观察样品用氨蒸气和其他碱性试剂处理后的颜色变化的情况。二氢黄酮类可转变为查耳酮类化合物，显橙黄色。,黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色。当分子中有邻二酚羟基取代或3,4 -二羟基取代时，在碱液中很快氧化，最后生成棕绿色沉淀。,（五）与五氯化锑反应,2%五氯化锑溶液，查耳酮为红色或紫红色沉淀黄酮（醇）和二氢黄酮显黄色至橙色,查耳酮专属反应,（六）Gibbs反应,将样品溶于吡啶中，加入Gibbs试剂显蓝或蓝绿色。Gibbs试剂:甲液：0.5%2,6-二氯苯醌氯亚胺的乙醇溶液。乙液：硼酸-氯化钾-氢氧化钾缓冲液（pH9.4）,检查5-OH对位未被取代的黄酮,第四节黄酮类化合物的提取与分离,一、提取黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇提取。一些多糖苷类可用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（0.1%盐酸，如果是黄酮苷应当慎用，避免苷键发生水解）。,大多数黄酮苷元宜用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等中极性溶剂提取，而对多甲氧基黄酮类游离苷元，甚至可用苯等低极性溶剂进行提取。,（一）乙醇或甲醇提取法,溶剂： 游离黄酮：9095%乙醇或甲醇 黄酮苷类：60%乙醇,方法：冷浸、渗漉和回流,（二）热水提取法 黄酮苷的提取，常用煎煮法（三）碱性水或碱性稀醇提取法 碱性水：Na2CO3、NaOH、Ca(OH)2 碱性稀醇：5%NaOH的50%乙醇液,碱提取酸沉淀法黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个方法。,槐米中芦丁的提取槐米（槐树Sophora japonica L. 花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH89，在此pH条件下微沸2030分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎1次，趁热抽滤。合并滤液，在6070下，用浓盐酸调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至中性，60干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，7080干燥得芦丁纯品。,在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热时会破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成（金羊）盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率,当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。,二、分离,（一）溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。药料水溶液则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。,有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水-醋酸乙酯，正丁醇-石油醚等。溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。,（二）梯度pH萃取法梯度pH萃取法适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，来达到分离的目的。,酸性：7，4-二OH（5%NaHCO3液 ） 7-或4-OH （5%Na2CO3液） 一般OH（0.2%NaOH） 5-OH （4% NaOH液）,（三）柱层析法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。,1.硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。,2. 聚酰胺柱层析聚酰胺的吸附原理： 通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。,固定相,移动相,聚酰胺柱层析可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。,黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时有下列规律：（1）酚羟基数目越多，吸附力越强,（2）酚羟基位置的影响：易形成分子内氢键的与聚酰胺的吸附力减小；,（3）分子内芳香化程度越高，共轭双键越多，吸附力越强；所以查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。,（4）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇,（5）分离游离黄酮与黄酮苷时：含水洗脱剂，黄酮苷先洗脱，当苷元相同，洗脱先后顺序一般是： 三糖苷双糖苷单糖苷苷元有机溶剂作洗脱剂，游离黄酮先洗脱。双重色谱性质 聚酰胺分子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺基团,（6）洗脱溶剂的影响聚酰胺与各类化合物在水中形成氢键能力最强，在有机溶剂中较差，在碱性溶剂中最弱。洗脱溶剂的影响（洗脱能力由强至弱）:尿素 DMF 甲酰胺 稀碱液 丙酮 甲乙醇 水,水,甲醇,丙酮,氢氧化钠水溶液,甲酰胺,二甲基甲酰胺,尿素水溶液,洗脱能力,弱,强,3. 葡聚糖凝胶(Sephadex gel)柱层析：对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex-G型及Sephadex-LH-20型。,葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的属性起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。,葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：,分离游离黄酮：吸附作用。凝胶对游离黄酮的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。极性小大顺序洗脱。,分离黄酮苷：分子筛（主导作用）洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。,总的洗脱顺序：糖多的苷糖少的苷游离苷元（极性小大）,葡聚糖凝胶柱层析中常用的洗脱剂有：碱性水溶液（如0.1mol/L NH4OH），含盐水溶液(0.5mol/L NaCl等)。醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水（不同比例）、t-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。其它溶剂：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。,（四）根据分子中某些特定官能团进行分离在黄酮类成分的混合物中，具有邻二酚羟基成分与无此结构的成分，可用铅盐法分离。有邻二酚羟基的成分可被醋酸铅沉淀，不具有邻二酚羟基的成分可被碱式醋酸铅沉淀，达到分离的目的。,与黄酮类成分混存的其它杂质，如分子中有羧基（如树胶、粘液、果胶、有机酸、蛋白质、氨基酸等）或邻二酚羟基（如鞣质等）时，也可被醋酸铅沉淀达到去杂目的。,铅盐法：脱铅：1、通入H2S 2、硫酸盐 3、磷酸盐 4、阳离子交换树脂,有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，可与不具上述结构的黄酮类化合物相互分离。,举例：从芹菜Apium graveolens L.种子中分离芹菜双糖苷（graveobiodide） A及B,一、理化检识二、色谱检识（一）纸色谱（PC）：适用性：分离各种黄酮及苷类的混合物。苷元：展开剂 一般用醇性溶剂 显色剂 氨蒸气、2AlCl3醇液苷类：“双向色谱法”：第一向根据分配作用，用醇 性溶剂，为正相分配色谱 第二向用水液(如醋酸、盐溶液） 为展开剂，反相分配色谱,第五节 黄酮类化合物的检识,规律：黄酮苷元：含水展开剂（如3%5%HOAc） （1）平面性分子如黄酮（醇）、查耳酮，Rf 0.7) 单糖苷 双糖苷 (0.5) 单糖苷 苷元(几乎不动),2、硅胶薄层色谱：适用性：分离和鉴定弱极性黄酮类化合物展开剂：甲苯-甲酸乙酯-甲酸并适当调整甲 苯和甲酸的比例、氯仿-甲醇等。3、聚酰胺薄层色谱：适用性：分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类展开剂：含水、醇、酸的溶剂，如乙醇-水（3:2），正丁醇-醋酸(100:1,100:2)等,第六节黄酮类化合物结构研究,目前主要采用的方法有：与标准品或与文献对照PC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）分析对比样品在甲醇溶液中及加入诊断试剂后得到的UV光谱1H -NMR 13C -NMR MS,一、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。一般程序： 测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UV谱和可见光谱以了解3,5,7,3,4有无羟基及邻二酚羟基； 苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。,（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱,多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成： 带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起。,B,B,带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。,A,A,不同类型黄酮类化合物的紫外光谱,1、黄酮及黄酮醇类共同点：两个主峰，峰形相似，强度相近；不同点：带位置不同，黄酮304350nm， 黄酮醇358385nm。 带、带均受取代基的影响而改变峰位和峰形，含氧取代会使相应的峰红移；羟基被甲基化或成苷使相应的峰紫移。,2、查耳酮及橙酮共同点：带很强，带较弱。查耳酮 带 220270nm，带 340390nm； 橙酮 带 370430nm，天然橙酮388413nm 3、异黄酮、二氢黄酮（醇）共同点：有苯甲酰系统，无桂皮酰系统， 带吸收强，带以肩峰或低强度 吸收峰出现。异黄酮 带245270nm；二氢黄酮（醇） 带270295nm,（二）加入诊断试剂后引起的位移及结构测定常用的诊断试剂：甲醇钠、乙酸钠、乙酸钠/硼酸、三氯化铝、三氯化铝/盐酸等,说明：,（1）+NaOMe或NaOAc, OHONa，变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加，红移 另有3, 4 -OH或3, 3 , 4 -OH时，在NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。（2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7, 4 -OH解离。,(3)与AlCl3形成络合物的能力,黄酮醇3-OH 黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH） 邻二酚羟基 二氢黄酮醇5-OH,酸性条件下，邻二酚羟基不与AlCl3络合；,非酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多。,1、诊断试剂对黄酮（醇）类的UV光谱影响（1）NaOMe：带红移4060nm，强度不变或增加， 示有 4 -OH;带红移5060nm，强度减弱， 示有3-OH,无4 -OH 7-OH游离，320330nm有吸收吸收带随测定时间延长而衰退， 示有3, 4 ；3, 3, 4 ；5,6,7；5,7,8；5, 3 , 4 等对碱敏感的取代。,（2）NaOAc:带红移520nm，示有7-OH；如有4 -OH，可以通过比较在甲醇钠及乙酸钠中光谱带位移情况去判断7-OH是否被取代 吸收带随测定时间延长而衰退，示有3, 4 ；3, 3, 4 ；5,6,7；5,7,8；5, 3 , 4 等对碱敏感的取代。,（3）AlCl3及AlCl3/HCl：根据只加AlCl3和加入AlCl3及HCl的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况, AlCl3/HCl 与MeOH比较：带红移3555nm，示只有5-OH， 红移5060nm，示同时有3-OH和5-OH， 红移60nm，示只有3-OH， 红移1720nm，示有5-OH 6-含氧取代；,AlCl3/HCl AlCl3 示有邻二酚羟基 带紫移3040nm，示B环有邻二酚羟基， 紫移20nm，示B环有邻三酚羟基； 紫移5065nm，示AB环均可能有邻二 酚羟基, AlCl3/HCl与 AlCl3比较：,AlCl3/HCl= AlCl3 示无邻二酚羟基,（4）NaOAc/H3BO3: 带红移1230nm，示B环有邻二酚羟基； 带红移510nm，示A环有邻二酚羟基。,山柰苷 山柰酚UVmax(nm) 带II 带I 带II 带IMeOH NaOMeAlCl3AlCl3/HCl NaOAcNaOAc/H3BO3,从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后，用PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光谱数据如下：,山柰酚3，7-二鼠李糖苷,二、1H-NMR,常用溶剂：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定。,黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)羟基的特征,5OH：12 ppm7OH：11 ppm3OH：10 ppm,氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对鉴别黄酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂，在试样中加入重水（ D2O）羟基质子信号消失。,（一）A环质子,15, 7-二-OH黄酮,黄酮类1H-NMR（三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定）,当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移。,27-OH黄酮,H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮在较低场，且相互位置可能颠倒。,（二） B环质子 6.5-8,1 4-氧取代黄酮类化合物,由于C环对H- 2,6的负屏蔽作用大于对H-3,5， 且H-3,5受4 -OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高， H- 2,6处于越低场的位置。,H- 3 , 5 6.5-7.1, d, J = 8.5HzH- 2 , 6 7.1-8.1, d, J = 8.5Hz,2 3 , 4 -二氧取代黄酮类化合物,H-2受C环负屏蔽和3 -OR屏蔽作用，H-6 也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6 H-2 H-5 。但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。,3 , 4 -二氧取代黄酮及 黄酮醇H-5 6.7-7.1 d, J=8.5HzH-2 7.2 d, J=2.5HzH-6 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz,33, 4,5 -三氧取代黄酮类化合物,若R1=R2=R3=H，则H-2 ,6 为单峰， 6.7-7.5若上述条件不成立（如3 或5 甲基化或苷化时），则H-2 ,6 分别为二重峰（J=2Hz）,（三） C环质子,1. 黄酮类,2. 异黄酮类,H-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，7.6-7.8。若用DMSO-d6作溶剂，则8.5-8.7。,3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇,1) 二氢黄酮,两个H-3, 分别为dd峰，中心位于2.8 ，J = 17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J = 17Hz（偕偶），11Hz（反偶）,H-2, dd, 5.2, Jtrans = 11Hz（反偶）, Jcis = 5Hz（顺偶）,（2）二氢黄酮醇,3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的值升高（向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。,H-2与H-3为反 式双直立键， J=11HzH-2 4.9H-3 4.3,H- ： 6.50-6.70 ( 1H,d, J = Ca.17.0 )H- ： 7.30-7.70 ( 1H,d, J = Ca.17.0 ),查耳酮：,苄氢:6.50-6.70( 1H,s ) 6.37-6.94( 1H,s, DMSO-d6 ),橙酮：,（四）糖上的质子,1. 单糖苷类 糖与苷元相连时，糖上1-H与其它 H比较，一般位于较低磁场区。因-OR (R=苷元) 不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（4.0-6.0）,(1)葡萄糖位于不同位置时端基H化学 位移的区别： C3-OR 1-H的 值约为5.8 C-5, C-6, C-7, C-4-OR 1-H的 值约为4.8-5.2,(2) 葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别 黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.8, d, J=7Hz （二直立键偶合系统） 黄酮醇3-O-鼠李糖苷5.0-5.1, d, J=2Hz （二平伏键偶合系统） 另外鼠李糖上的C-CH3 0.8-1.2, d, J=6.5Hz,化合物 糖上的H-1 黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.70-6.00黄酮醇7-O-葡萄糖苷 4.80-5.20黄酮醇4-O-葡萄糖苷 黄酮醇5-O-葡萄糖苷 黄酮醇6及8-C-糖苷黄酮醇3-O-鼠李糖苷 5.00-5.10二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷 4.10-4.30二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷 4.00-4.20,糖上的氢,2. 双糖苷类末端糖上的H-1因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而较H-1处于较高场的位置。,取代基 甲基 2.04-2.45 ( 3H,s ) 乙酰氧基 2.30-2.45 ( 3H, s ) 甲氧基 3.45-4.10 ( 3H, s ),苯环上其他取代基的氢：,三、13C-NMR,方法： （1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较； （2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算； （3）选用各种一维和二维NMR技术。,（一）骨架类型的判断,根据中央三碳链的碳信号，即先根据羰基碳的值，再结合C2、C3在偏共振去偶谱中的裂分和值判断。,（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法,黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：,四、质谱在黄酮类结构测定中的应用,多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定。,但是当测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，则采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰M+及具有偶数电子的准分子离子峰(quasi-molecularion peak) M+H +。,(一) 游离黄酮类化合物的电子轰击质谱 (El-MS),游离黄酮类化合物的El-MS中，除分子离子峰M+外，也常常生成M-1+即(M-H)基峰。如为甲基化衍生物，则可以得到M-15+即(M-CH3)离子。,黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：,途径-I（RDA裂解）： 120 102,途径-II,此外，还有分子离子M+生成M-1+(M-H)及M-28+(M-CO)；由A1生成A1-28+(A1-CO)及B2生成B2-28+(B2-CO)等碎片离子。,1黄酮类裂解基本规律,A-环的取代图式可通过测定A1+的m/z的值进行确定 。同样，根据B-环碎片离子的m/z值，也可精确测定B环的取代情况。,一些黄酮类化合物的质谱数据,黄酮在有四个以上氧取代基时，常常给出中等强度的A1及B1碎片，它具有重要的鉴定意义；但是黄酮醇则不然，当氧取代超过四个以上时，只能产生微弱的Al+及Bl+碎片离子。,在3，6及8-位含有C-异戊烯基的黄酮类，除一般黄酮裂解途径外，还产生一些新的碎片离子。如：化合物(I)中A环上的，-二甲烯丙基在裂解过程中脱去C4H7碎片，并重排成稳定的卓瓮离子() 。,在6-及8-位含有甲氧基的黄酮可失去CH3，得到M-15+强峰(常为基峰)，随后又失去CO，生成M-43离子：,2黄酮醇类质谱,多数黄酮醇苷元，分子离子峰是基峰，在裂解时主要按途径-进行，得到B2+离子，继续失去CO形成的B2-28+.离子。与途径相比，途径I通常不太主要。其中，A+H+是来自A-环的主要离子，其上转移的H来自3-OR基团。,在黄酮醇全甲基化衍生物的质谱图上，B2+离子应当出现在m/z105(B环无羟基取代)，或135(-OCH3，示B环有一个羟基)，或165(有两个-OCH3，示B环有两个羟基)或195(有三个-OCH3，示B环有三个羟基)等处，其中最强的峰即为B2+离子。,具有2-OH或2-OCH3的黄酮醇类在裂解时有个重要特点，即可以通过失去OH或 OCH3，形成一个新的稳定的五元杂环。,(二)黄酮苷类化合物的FD-MS,黄酮苷类化合物在EI-MS上既不显示分子离子峰，也不显示糖基的碎片，故不宜用 EI-MS测定。 而FD-MS谱可给出强烈的M+及M+H+。还给出葡萄糖基的某些碎片，为化合物的结构鉴定提供了重要的信息。,在FD-MS中，因为(M+23Na)离子的强度随着溶剂极性及发射丝电流强度的改变而变化，可用以帮助区别分子离子峰(M)+及伪分子离子峰M+1+。,练习1.有一黄色单体，分子式为C15H10O5, FeCl3反应阳性，HCl-Mg反应阳性，Molish反应阴性，ZrOCl2反应黄色，加枸橼酸黄色消退，SrCl2反应阴性。UV(max):MeOH 267, 296(sh), 336NaOMe 275, 324, 392(强度不降）AlCl3 376, 301, 348, 384AlCl3/HCl 276, 299, 340, 381NaOAc 274, 301, 376NaOAc/H3BO3 268, 302(sh), 3361H-NMR(DMSO-d6)：6.18（1H, d, J=2Hz), 6.38(1H,s), 6.50(1H, d, J=2Hz), 6.90(2H, d, J=8Hz), 7.70(2H d, J=8Hz). 该化合物乙酰化后1H NMR测定乙酰基质子数为9H。写出结构式，并注明质子信号归属。,某黄色结晶，分子式为C15H10O5，盐酸镁粉反应阳性，Molish反应阴性，Gibbs反应阳性。UVmax(nm)IR(cm-1): 33803250, 1665, 1610, 15811H-NMR(TMS, DMSO-d6):6.30(1H,s), 6.80(1H,d,J=2Hz), 6.69(1H,d, J=2Hz)6.91(2H,d, J=8Hz), 8.29(2H, d, J=8Hz)10.40(1H,s,D2O消失)，10.88(1H,s,D2O消失)，13.20(1H,s,D2O消失)请分析推出结构，并确定核磁及红外峰的归属。,某化合物为浅黄色粉末结晶，mp260262，盐酸镁粉反应呈阳性。UVmaxnm：1H-NMR(DMSO-d6)ppm：6.55(1H,s)、6.22(1H,d,J=2.0Hz)、6.64(1H,d,J=2.0Hz)、7.88(1H,d,J=8.50Hz)、7.03(1H,d,J=8.50Hz)、3.90(3H,s)、7.03(1H,d,J=8.50Hz)、7.88(1H,d,J=8.50Hz)请推测其结构并确定核磁归属。,某化合物淡黄色针晶，mp300-3