核酸凝胶电泳.终.ppt

核酸凝胶电泳 什么是电泳 带点颗粒在电场作用下 向着与其电性相反的电极移动 称为电泳 生物大分子如蛋白质 核酸 多糖等大多都有阳离子和阴离子基团 称为两性离子在电场中 带电颗粒向正极或负极迁移 迁移的方向取决于它们带点的符号 凝胶电泳有几类 一 琼脂凝胶电泳 分辨DNA范围为0 2 50kb 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分辨范围为1 1000kb 三 脉冲电场凝胶电泳 分离到高达107bp的DNA大分子 前言 核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一 用于分离 鉴定和纯化DNA或RNA片段 核酸凝胶电泳的基本原理凝胶电泳的原理比较简单 当一种带电分子放在电场当中时 它们就会以一定的速度移向适当的电极 带点分子在电场作用下的移动速度 称之为电泳迁移率 它同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比 也就是说 电场强度越大 电泳分子所携带的静电荷越多 其移动速度也就越快 反之则慢 在哪电泳中 使用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质 从而将电泳分子的对流运动降低到极低 使电泳分子的移动速度与其分子的摩擦系数成反比 已知摩擦系数是分子大小 极性及介质黏度的函数 因此根据分子大小的不同 构型或形状的差异 以及所带净电荷的多寡 便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成分彼此分离开来 在生理条件下 核酸分子的糖 磷酸骨架中的磷酸基团 是呈离子状态的 从这种意义上讲 DNA和RNA的多核苷酸链可称为多聚阴离子 因此 当核酸分子被放置在电场当中时 它们就会向正极的方向迁移 由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质 相当数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷 因此它们能以同样的速度向正极方向迁移 在一定的电场强度 DNA分子的这种迁移速度 亦即电泳迁移率 取决于核算分子本身的大小和结构 分子质量较小的DNA分子比分子质量较大的DNA分子 具有较紧密的构型 所以其电泳迁移率也就比同等分子质量的的松散型的开环DNA分子或线性分子要快些 这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理 常见的电泳仪 水平电泳仪 垂直电泳仪 脉冲电泳 电泳的梳子 电泳槽 电泳仪 一 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法 对于分子量较大的样品 如大分子核酸 病毒等 一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离 琼脂糖凝胶具有网络结构 物质分子通过时会受到阻力 大分子物质在涌动时受到的阻力大 因此在凝胶电泳中 带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量 而且还取决于分子大小 这就大大提高了分辨能力 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关 分辨DNA片段范围0 2 50kb 而要分辨较小分子质量的DNA片段 则要用聚丙烯酰胺凝胶 其分辨范围为1 1000bp 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力也就越强 反之 浓度越低 孔隙就增大 其分辨能力也就越弱 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质 相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷 因此它们能以同样的速率向正极方向移动 琼脂糖凝胶电泳的操作 操作步骤 配胶EB染色点样胶图分析成像拍照电泳 1 配胶按所要分离的DNA分子的大小 称取适量的琼脂糖粉末 放入锥形瓶 加适量1 TAE电泳缓冲液 然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成透明状 适当冷却后倒入胶托 胶完全冷凝后放入电泳槽 电泳槽里的缓冲液必须没过胶面 铺胶 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 2 EB染色溴化乙锭是一种扁平分子 可以嵌入核酸双链的配对碱基之间 在在紫外照射EB DNA复合物时 出现不同的效应 注意 严格区分污染区和非污染区 不把污染区的物品拿到非污染区碰过EB的手套要及时丢弃 3 点样根据样品不同可分两种点样体系 A 样品 6XloadingbufferB 样品可以直接点样 4 电泳点完样后连接电源 设置好电源的参数 开始电泳 当溴酚蓝的带 蓝色 的移动至一定长度即可停止电泳 电压要求 20V CM胶 在样品出孔用低压 3V CM 15min 然后调回标准电压 跑出的条带较好 成像拍照 胶图分析 注意事项 一 配胶1 电子称的使用 要时刻注意保持电子称的精确性 保持清洁 根据不同的浓度的胶称取琼脂糖 2 加TAE的量要适当 以避免配出来的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低 3 倒胶前胶托一定要洗干净 并檫干 倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡 若胶液的温度太高胶托容易变形 二 EB染色1 碰到EB的手套要及时丢弃 2 加量要适当 加EB至终浓度0 5 g ml3抹布要严格区分 不可交叉使用 三 点样电泳1 加样时 枪头要上紧 吸样均一准确 排液时吸头不要有残留 2 点完样后及时盖上胶垫 注意不要盖反 3 点电泳前最好检查待用胶是否合格 点电泳时要对准胶孔 尽量点完所有的样 4 点完样勿忘marker 并摆正胶位 电泳仪正负极不要插反 电泳槽的盖子要盖紧 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 简称Acr 和交联剂N N 一亚甲基双丙烯酰胺 简称Bis 在催化剂过硫酸铵 AP N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 作用下 聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶 并以此为支持物进行电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将DNA或蛋白质分离成若干条区带 如果分离纯化的样品中只含有同一种DNA蛋白质 样品电泳后 就应只分离出一条区带 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键 并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷 掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异 因此 各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率 不再受原有电荷和分子形状的影响 只是棒长的函数 这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类1 变性聚丙烯酰胺凝胶 SDS PAGE 变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学常用技术之一 是根据寡核苷酸的大小来分离 因此可将全长产物与不完整的短分子分开 电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸 电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带 将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下 主要用于单链DNA片段的分离或纯化 用途 放射性DNA探针的分离 DNA测序等 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 native PAGE 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 Native PAGE 或称为活性电泳是在不加入SDS和疏基乙醇等变性剂的条件下 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用于酶的鉴定 同工酶分析和提纯 使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷 尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性 对于生物大分子的鉴定有重要意义 用于双链DNA片段的分离于纯化 用途 制备高纯度的DNA片段 操作步骤 制板 制浓缩胶 电泳槽安装 加样 制分离胶 染色 电泳 固定 剥胶 脱色 观察结果 1 制胶1 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶 并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子 小心避免混入气泡 再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙 将凝胶垂直放置于室温下 2 浓缩胶聚合完成后 30分钟 小心移出梳子 把凝胶固定于电泳装置上 上下槽各加入Tris 甘氨酸电极缓冲液 2 样品制备取样品加入0 5ml2 SDS凝胶加样缓冲液混匀 3 加样及电泳用吸嘴吸取50 l 从加样孔底部缓慢加样 注意 加样时不得插伤凝胶孔面 不得产生气泡 样品不得溢出加样孔 4 接电源与电泳上槽接负极 下槽接正极 调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后 把电压提高到120V 凝胶上所加电压为8V cm 继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm 约2 3小时 然后关闭电源 取出插头 5 剥胶从电泳装置上卸下玻璃 用水果刀撬开玻璃板 并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位 6 染色与脱色用考马氏亮蓝染色液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色1 2小时后 用脱色液在脱色摇床上与脱色3 4次 每次20 30分钟 注意事项 1 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤 操作时应避免沾在脸 手等皮肤上 最好戴一次性手套进行操作 2 过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应 故一定要新鲜 贮存过久的过硫酸铵商品不能使用 此外 10 过硫酸铵必须现配现用 3 灌制凝胶时 应避免产生气泡 因为气泡会影响电泳分离效果 4 刚灌制注分离胶混合溶液后 应在分离胶液面上加1 2cm高得水层 以阻隔空气 胶液面上加水层时要特别小心 缓缓叠加 以免冲坏凝胶的胶面 5 聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长 电泳过程中产热多 特别是夏天产热更多 顾电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量 或在4冰箱中电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 三 脉冲电场凝胶电泳 PFGE 在脉冲电场中 DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变 在标准的PFGE中 第一个脉冲的电场方向在另一侧成45 夹角 由于琼脂糖凝胶的电场方向 电流大小及作用时间都在交替变化 使得DNA分子能够随时调整其游动方向 以适应凝胶孔隙的无规则变化 与相对分子质量较小的DNA相比 相对分子质量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位 使其按新的方向游动 应用脉冲电场凝胶电泳技术 可成功分离到高达107bp的DNA大分子 倒转电场系统 垂直交变电场 箝位匀强电场系统 反转电场系统 脉冲电场凝胶电泳类型 脉冲电泳的操作步骤 DNA样品制备 限制酶消化 脉冲 分离 纯化大的DNA片段 EB染色 拍照 紫外递质监测DNA 收集目的DNA 1 脉冲电泳凝胶电泳的DNA样品制备 以金黄色葡萄球菌为例 1 取100ml对数生长期的金黄色葡萄球菌细胞于4 5000g离心5分钟 2 用20mlTEN缓冲液冲洗沉淀 同样条件离心5分钟 在用10mlEC缓冲液使细胞悬浮 3 取1 5ml细胞样品与相同体积含2 SeaPLaque琼脂糖的EC缓冲液迅速混合均匀并等分流溶液至封闭的模块中于4 凝固 混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50 4 对于每一个菌株 需要15 20个凝胶块 将它们放至含有30 45ug mlRNase的10mlEC缓冲液中 于37 振荡过夜 5 去掉裂解缓冲液 换为10mlESP缓冲液于50 轻度摇温育48h 6 将凝胶块放在10ml含有174ug ml苯甲基磺酰氟 PMSF 的TE缓冲液中 室温温育4h 以灭活ESP中的蛋白酶K 7 用TE清洗琼脂块6h 至于TE中4 保存 2 限制酶消化 1 25ul10 x反应缓冲液 30U限制酶 加双蒸馏水至250ul混匀 2 取一个凝胶块置其中 合适温度下过夜后 用TE缓冲液洗涤并贮存 3 应用PFGE对样品DNA进行分析 1 用0 5xTBE缓冲液制备一个0 8 SeakemHGT琼脂糖凝胶 胶的厚度尽量与样品凝胶块相符 若用WideMini SubCell进行电泳的话 50ml该溶液即可 2 凝胶后 小心移去样品梳 将凝胶块用小刀切成与样孔一致的大小 将样心的插入加样孔 避免产生气泡 3 把胶放入电泳槽内 加缓冲液 刚好覆盖胶的表面即可 缓冲液事先14 冷却 4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连 打开电源 调节蠕动泵到适当流速 5 10mL rain 或打开变速泵至40 5 通过计算机启动极性转换程序 大于50kb的限制性片段在1 2s和0 4s正向和反向的电脉冲下得以分离 时间一般为3 5h或更长 小于50kb的限制性片段在0 4s正向和0 2s反向的电脉冲 比率为2 1 下得以分离 时间为3 5h 6 在0 5 g mL溴化乙锭中进行染色并拍照 4 分离 纯化大的DNA片段 1 凝胶染色 分析后 在目的带前 靠近正极处 切一个0 25cm2左右的槽 注入0 8 Seaplaque琼脂糖 使之凝固 2 重新打开极性转换开关 用紫外递质检测DNA的迁移 当目的带进入Seaplaque凝胶中时 关闭开关 切下目的带 移至1 5mLEP管中 3 加入2 L的tRNA 30 L5mol LNACl 370 L蒸馏水 在65 70 之间 化胶并保温10min 4 苯酚 氯仿500 L抽提两次 5 用2 5倍体积95 乙醇和1 10体积NaAc3mol L pH5 2 于 70 10min沉淀水相 再用70 乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中 脉冲电场凝胶电泳图 注意事项1 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶 2 PMSF是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂 即有毒又挥发 操作时应在通风橱中进行 3 用蛋白酶K包埋的材料时50 温育时间很长 24 48h 有些学者提出如此长时间不必要 Mortimeretal 1990 且可能造成高分子质量DNA降解 在实验中可视情况而定 4 琼脂糖凝胶块在TE pH7 6 中4 可存放数年 如在0 5mol LEDTA中可存放更长时间 5 一些高压电源并不适合脉冲