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生物显微技术与电镜技术 海洋生物系王庆恒 第一篇生物显微制片技术第二篇显微镜与显微摄影第三篇电子显微镜 第一篇生物显微制片技术第一章概论第二章生物显微制片的步骤和原理第三章其他切片法 第一章概论 第一节制片的目的与任务第二节生物制片的分类临时制片按保存时间永久制片活体观察法按制作方法非切片法切片法 车轮虫 夜光虫 羽纹藻 变形虫 非切片法整体封藏法 昆虫口器 浮游动物涂片法 血液 粪便伸展法 皮下结缔组织 肠系膜磨片法 牙齿 耳石 贝壳压碎法 根尖 果蝇唾液腺分离法 木材纤维 铬酸 硝酸 肌纤维 KOH HNO3 切片法石蜡切片法 旋转切片机 周期短 切片薄且能连续切片 但是易使组织发生收缩变脆 不能切大型材料和坚硬 易碎材料 火棉胶切片法 滑走切片机 价格贵 时间长 不能连续切片 切片较厚 但是能防止高温对材料产生的收缩现象 能包埋较大 较硬 较脆的材料 英国Finesse325旋转切片机 德国Leica公司SM2000R滑走切片机 切片法冰冻切片法 冰冻切片机 周期很短 切片厚切不能连续切片 融化后各细胞易分散而失去相互联系 能很好保存脂肪和酶类 因而适合脂肪 神经组织和组化切片 在医学快速诊断上广泛使用 德国LeicaCM3050S冰冻切片机 取材固定洗涤脱水透明浸蜡包埋切片贴片染色封藏 第二章显微切片的步骤和原理 第一节取材和固定 一 杀死 固定和保存的概念杀死 两层含义 一是把用于取材的动物处死 二是使用化学药品 迅速地终结生物组织的生理活性 固定 在杀死的基础上 把组织或细胞按生活的状态固定下来 使在以后的制片过程中不发生任何变化 保存 将固定好的材料浸泡于保存液使其不发生变质 二 取材的要求固定前按需要配制好固定液 材料尽可能新鲜 研究正常结构时 选择健全而有代表性的部位 研究病理结构时 将病变组织同周围正常组织一起采取 切取材料时 动作快而仔细 尽量不要损伤材料 做好记录 第一节取材和固定 三 固定的理论 一 固定作用的原理化学作用 凝结作用物理作用 沉淀作用 二 固定的目的和理想的固定剂迅速渗透 防止组织自溶和腐败使细胞内各种成分沉淀保存下来 从而保持细胞与生活状态相近似的形态和结构避免组织或细胞发生收缩或膨胀能增加着色能力和媒染能力固定剂同时能作为良好的保存剂对组织有硬化作用 并具一定的坚韧性 但又不能使材料过于坚硬或变得松脆 第一节取材和固定 第一节取材和固定 三 固定象酸性固定象 在酸性固定剂中细胞分裂间期的染色质 核仁 纺锤丝等结构被保存 细胞质固定成海绵质 核质和线粒体被溶解 碱性固定象 在碱性固定剂中染色质 纺锤丝等结构被溶解 核质和线粒体被保存 细胞质固定成透明质状态 植物细胞的液泡也能被保存 四 固定剂单一固定液的种类 性质及其应用酒精 甲醛 冰醋酸 苦味酸 铬酸 重铬酸钾 氯化汞 碘 锇酸混和固定液的种类 性质及其应用Zenken氏液 Bouin氏液 Carnoy氏液等等 第一节取材和固定 A 酒精性质 液态 挥发性 优点 渗透力强 固定时间短 具脱水功能 70 酒精可兼做保存剂缺点 材料收缩 还原剂 易被氧化 不宜与铬酸 重铬酸钾或锇酸等配合使用 常与甲醛 冰醋酸 丙酸等配合使用 B 甲醛 福尔马林 蚁醛 性质 气体 常见的为其水溶液 挥发性 优点 渗透力强 对磷脂有保存作用缺点 材料收缩 固定易过度 还原剂 易被氧化 不宜与铬酸或锇酸等配合使用 常与酒精等配合使用 C 冰醋酸 冰乙酸性质 液体 挥发性 优点 渗透力强 对蛋白有保存作用缺点 材料膨胀 宜与铬酸 酒精 甲醛等配合使用 D 苦味酸性质 三硝基苯酚 淡黄色结晶 饱和水溶液优点 渗透力强 沉淀蛋白质 核蛋白 核酸 一般不再溶解缺点 材料收缩 常与冰醋酸配合使用 固定后不能用水洗涤 用酒精洗涤 E 铬酸性质 三氧化铬 红棕色结晶 的水溶液 强氧化剂优点 沉淀蛋白质 核蛋白 核酸 一般不再溶解缺点 材料收缩 渗透力弱 固定时间长 不宜与还原剂类的固定剂配合使用 F 重铬酸钾性质 橙色晶体 强氧化剂优点 调节不同的pH值可得到两种固定象缺点 渗透力弱 固定时间长 强氧化剂 不宜与还原剂类的固定剂混合使用 G 氯化汞性质 无色粉末 剧毒优点 渗透力强 对蛋白质有强烈的沉淀作用缺点 材料收缩 常与甲醛 冰醋酸 丙酸等配合使用 用碘除汞 H 碘性质 棕红色晶体优点 渗透力强 野外使用方便缺点 易挥发 标本不能长期保存 溶于碘化钾溶液配置固定液 使用时可与福尔马林配合使用 是低等单细胞生物 浮游生物的良好固定液 I 锇酸性质 灰黄色结晶 强氧化剂 剧毒优点 目前最好的固定剂之一 脂类物质唯一的固定剂缺点 渗透力弱 组织固定不均匀 价格昂贵 取材较小 固定后用过氧化氢漂洗 一 洗涤的目的和原则洗涤的目的 将组织间隙中的固定剂清洗干净以免妨碍染色或使材料在后续处理中变质 洗涤的原则 1 固定剂为酒精 或酒精混合物 一般不要求冲洗 如有必要 必须采用与固定剂中的酒精浓度相同或相近的酒精 2 凡是含有铬酸 重铬酸钾 锇酸的固定剂 必须用流水冲洗 冲洗时间应等于或多于固定时间 3 如固定液中含有氯化汞 应根据溶液的性质用水或酒精冲洗 冲洗完毕必须在70 酒精中加碘液去汞 4 含有苦味酸的固定剂 宜选用70 的酒精进行洗涤 苦味酸的黄色在70 酒精中能自行脱去 或加入碳酸钾饱和水溶液除去 第二节洗涤和脱水 二 脱水目的 使组织中的水分完全去除 并使组织硬化脱水剂 酒精 丙酮 甘油 正丁醇 叔丁醇 二氧六圜酒精脱水 如需过夜 应停留在70 酒精中丙酮脱水力和收缩作用都较酒精强甘油常用于藻类 菌类和柔弱材料脱水 特别在整体制片法中应用广泛正丁醇 叔丁醇 二氧六圜均为石蜡溶剂 用其脱水后的材料不需要透明 可直接浸蜡 目的 使组织中的酒精或者丙酮被透明剂替代 使石蜡可以顺利的进入组织中 或增强组织的折光系数 并能和封藏剂混和进行封藏 透明剂 二甲苯 甲苯 苯 氯仿 香柏油 丁香油 第三节透明及透明剂 a 二甲苯优点 作用迅速缺点 易使材料发生收缩变脆b 甲苯优点 材料不易变脆缺点 渗透较慢c 苯优点 对组织收缩少缺点 有毒 易挥发 易爆炸 渗透慢 d 氯仿优点 不易使组织变脆 极适于大块材料缺点 透明速度慢e 香柏油优点 对组织的收缩和硬化程度最小缺点 透明速度很慢 不易为石蜡代替f 丁香油优点 渗透快 透明时间短缺点 易使组织变脆 蒸发太慢不易干燥 利用石蜡将透明剂去除 使石蜡完全浸入细胞的每个部分 同时使石蜡与材料成为一个整体而便于切片 一般使用熔点在52 56 结构细致 光滑而均匀的石蜡 实际使用时 将不同熔点的石蜡混和使用 也可加入少量蜂蜡 由于新石蜡质地疏松 需要将其放在容器中进行长时间煮炼 变得紧密并去除空气和水 同时 用四层纱布过滤去杂质 第四节浸蜡与包埋 一 蜡块的修整与固着二 切片过程 一 切片机 旋转切片机 二 切片刀通常分为平凹型 双平型 双凹型 切片刀的角度 一般以5 8度为宜 三 石蜡切片时常见问题 原因及补救 第五节切片 贴片剂 蛋白甘油一 配制方法新鲜鸡蛋打孔 倒出蛋白 加入等量甘油和少许防腐剂 用力搅动将蛋白打散后 洗纱布过滤放冰箱备用 二 注意事项少量蛋白甘油即可 展片时 温度不能过高 第六节贴片 一 染色剂染色剂的作用 使组织与组织间各部分显现出不同的颜色 达到镜检的效果 二 染色剂的种类碱性染料天然染料按化学性质分中性染料按来源分酸性染料人工染料胞核染料按染色对象分胞浆染料脂肪染料 第七节脱蜡与染色 三 常用染色剂碱性染料 苏木精 洋红酸性染料 酸性品红 苯胺蓝 刚果红 橘黄G 甲基蓝 伊红 苦味酸中性染料 瑞氏染色粉 姬姆萨染色粉脂肪染料 苏丹红 苏丹黑 油溶蓝 第七节脱蜡与染色 四 染色过程中使用的其他辅助试剂a 媒染剂有的染料不能直接使细胞或组织着色 媒染剂通常能在水中电离金属离子 金属盐类或金属氧化物 而与染料结合成有色复盐 不溶于水或酒精 使用方法 1 媒染剂与染色剂通常分开配置 切片先浸入媒染剂后移入染色剂 2 两者混合 产生可溶性复盐 与组织结合后形成新的复盐 3 混合时加入酸溶液 先阻止复盐产生 染色后再去酸 第七节脱蜡与染色 b 固色剂防止组织块或切片脱色 染色后可浸入固色剂中 如氢氧化钙 钼酸铵等 c 漂白剂锇酸或铬酸处理过的样品往往变黑 难以染色 可在冲洗后或染色前使用过氧化氢漂白 d 分色剂使不该着色的染料去掉 使结构着色对比清晰 碱性染料常用盐酸 醋酸和丁香油作分色剂 酸性染料常用硫酸或微带碱性水作分色剂 第七节脱蜡与染色 封藏剂的选择 透明 折光率高 干燥后能凝固常用封藏剂 中性树胶 甘油胶 糖浆 第八节封藏 第二篇显微镜与显微照相术 第一章概论第二章光学透镜第三章显微镜的光学原理第四章显微镜的基本光学参数第五章显微镜的主要光学部件第六章显微镜的使用及其注意事项第七章各种显微镜第八章显微镜几种常用的附件第九章显微照相术 第一章概论 第一节光学显微镜的发展历史1590年制造出第一台原始的显微镜 1610年 意大利伽利略制造了具有物镜 目镜和镜筒的复式显微镜 1611年 开普勒阐明了显微镜的基本原理 1625年 法布尔首先提出显微镜 microscope 一词 1665年 英国罗伯特 胡克 制造出能放大140倍的显微镜 不久 荷兰的安东尼 范 列文虎克制作出放大率达270倍的显微镜 实现了历史性的发明 1684年前后 荷兰学者惠更斯设计并制造出结构简单且效果较好的双透镜目镜 惠更斯目镜19世纪中叶 恩斯特 阿贝提出了显微镜的完善理论 1902年 艾夫斯奠定了现代双目镜的基本系统 1941年在德国的蔡司公司制造出第一台相差显微镜 60年代中期研制出诺尔曼斯基微分干涉显微镜 80年代后期研制出激光共聚焦扫描显微镜 第一章概述第二节显微镜的分类 光学显微镜单式显微镜电子显微镜复式显微镜一 单式显微镜放大镜 10 以下 解剖显微镜 一般200 以下二 复式显微镜由两组以上透镜组成 具有目镜 物镜 集光器等光学系统 包括实验室常用的显微镜 暗视显微镜 相差显微镜 偏光显微镜 荧光显微镜等 各式解剖镜 第二章光学透镜第一节透镜的类型 透镜 由两个折射面包围一种透明介质形成的光学零件叫做透镜 透镜是光学仪器的核心部分 是显微镜中最重要的组成部件 按透镜的性质分 1 凸透镜 又称为会聚透镜或正透镜 是一种能使光线向光轴靠拢的透镜 它中间厚 边缘薄 或其中一面为球面而另一面为平面 2 凹透镜 又被称为发散透镜或负透镜 是一种能使光线向光轴散开的透镜 其特点为边缘厚而中间薄 或其中一面为凹面而另一面为平面 F F 典型的凹凸透镜 第二章光学透镜第一节透镜的类型 按透镜的复杂程度分 1 单透镜 只由两个球面或其中有一面为平面构成的透镜2 复透镜 由两个或两个以上的单透镜胶合而成的透镜 最常见的是由两块单透镜胶合而成的双胶合透镜 3 透镜组 由两个或两个以上相互隔开一定距离的单透镜或复透镜组成的系统称透镜组 第二章光学透镜第二节凸透镜成像 显微镜的物镜 目镜和聚光镜都是由多个单透镜或复透镜组成的透镜组 但其实质上只相当于一个凸透镜 凹透镜所成的像总是缩小的虚像 在显微镜上不能单独使用 凸透镜的成像规律为 若u 2f 则2f v f 异侧倒立缩小的实像若2f u f 则v 2f 异侧倒立放大的实像若u f 则v 不成相若u f 则同侧正立放大的虚像 第二章光学透镜第三节透镜的像差 某一物点发出的光束 经过透镜以后 仍然是同心光束 还都会聚在一点 由这种方式形成的像点称为理想像点 由理想像点构成与原物形状 颜色完全相似的像 称为理想像 实际上 从一点发出的光束在通过透镜后并不完全会聚于一点 而是分布在空间一个很小的区域内 成为一个模糊的斑点或称弥散圈 同样 一个物体通过透镜后也不可能形成一个与原物体完全相似的像 造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差 第二章光学透镜第三节透镜的像差 单色相差轴上点的单色像差 球差慧差像散轴外点的单色像差 场曲畸变复色像差 色差 一 轴上点的单色像差 球差由光轴上一点发出的光线经透镜折射后 不再是同心光束 入射光线的孔径角不同 其出射光线与光轴交点的位置就不同 相对于理想像点有不同的偏离 这就是球差 孔径角越大 则光线的折射率越大 球差及球差的消除 二 轴外点的单色像差 1 慧差慧差即慧形像差 又叫侧面球差 它是光轴外一点发出宽光束通过透镜折射会聚所形成的一种像差 其形成原因是由于透镜边缘一带的光线与透镜主轴一带的光线所会聚的焦点位置和影像大小有差别 得到的影像的一端宽大虚散而较暗 另一端则窄小清晰而较亮 严重影响图像的清晰度 慧差 二 轴外点的单色像差 2 像散当轴外一点发出很细的光束投射在透镜上成像时 由于细光束的光束轴与法线不重合 其出射光束不再存在对称轴 而只存在一个对称面 子午面 与此细光束对应的微小波面并非旋转对称 在不同方向上有不同的曲率 因此形成像散光束 存在着像散的光学系统 不能使物面上所有物点形成清晰的像点群 二 轴外点的单色像差 3 场曲即像场弯曲 每个物点都能得到一个清晰的像点 但是整个像面不是一个平面 而是一个回转曲面 因此 像平面是不清晰的 当使用存在场曲的镜头拍摄时 如果景物中间部分清晰 则边缘部分模糊 反之 当景物边缘部分清晰时 则中间部分模糊 B A A B 二 轴外点的单色像差 4 畸变产生畸变的原因是在一对物 像共轭平面上 垂轴放大率随视场大小而改变 不再保持常数 使像相对于物失去了相似性 如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而大于理想像高 即为正畸变 又叫枕形畸变 如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而小于理想像高 即为负畸变 又叫桶形畸变 a 理想图像b 正畸变c 负畸变 三 复色像差 色差绝大部分光学仪器用白光成像 白光是由各种不同波长 或颜色 单色光的组合 各种色光之间成像位置和大小也有所差异 也即有色差的存在 这是由于透明介质对不同波长的单色光具有不同的折射率 1 位置色差描述轴上物点用不同色光成像时成像位置差异的像差称为位置色差 也称为轴向色差 同一透镜对不同色光有不同焦距 当透镜对于光轴上一点成像时 按色光的波长的由短到长 每种色光形成的像点离开透镜由近到远地排列在光轴上 这就是位置色差 2 倍率色差当光学系统校正了位置色差以后 可认为两种色光的像面重合在一起 但对于轴外点来说 由于不同色光的焦距不等而放大率不等 因而有不同的像高 光学系统对不同色光的放大率的差异称为倍率色差 也称放大率色差或垂轴色差 倍率色差破坏轴外点像的清晰程度 造成白色像的模糊 色差 色差的消除 第三章显微镜的光学原理第一节眼睛 眼睛的分辨率眼睛能看清落在视网膜上二像点的最短距离称为眼睛的分辨率 它主要由组成网膜的视神经细胞的直径决定 视神经细胞所能分辨的二像点之间的最小距离 至少应该等于两个细胞的直径 人眼的理论极限分辨率为6 m 刚好能分辨开的两点对于眼睛物方节点所张的角度 称为极限分辨角 眼睛的成像光路图 6 m l 23mm 60 第三章显微镜的光学原理第二节放大镜 放大镜的放大率公式 通常采用以下形式 250 f 由上式可知 放大镜的放大率仅由其焦距所决定 焦距越小则放大率越大 由于单透镜有相差存在 加上加工的原因 不能期望以减少凸透镜的焦距来获得很大的放大率 简单放大镜放大率都在10 以下 构造相对复杂的为解剖显微镜 它由几个透镜组成 其放大率在200 以下 放大镜的放大倍数越高 其焦距越短 工作距离也越短 第三章显微镜的光学原理第三节显微镜 物体AB位于物镜前方 离开物镜的距离在物镜一倍焦距和二倍焦距之间 所以 它经物镜后形成一个放大倒立的实像A B 并使A B 恰位于目镜的物方焦点F2处 或者在靠近F2的位置上 再经过目镜放大为虚像A B 后供眼睛观察 虚像的位置取决于F2和A B 的距离 可以在无限远处 也可以在观察者的明视距离处 A B B L1 L2 F2 A A 眼瞳 B 第四章显微镜的光学参数 一 数值孔径数值孔径 numericalaperture NA 也叫 镜口率 简称NA值 它是物镜和聚光器的最主要的技术参数之一 是判断二者性能高低的最为重要的标志 物镜的数值孔径在很多方面直接决定显微镜的光学性能 其大小通常都直接刻在显微镜的物镜和聚光器的外表面 物镜上的NA值表示物镜与被检物体之间介质的折射率 和孔径角 u 半数正弦值的乘积 其计算公式为 NA sin u 2 第四章显微镜的光学参数 二 分辨率分辨率 resolvingpower 也叫分辨力 是指物面上刚好能分辨开的两物体之间的最小距离 它是衡量显微镜性能的一个重要技术参数 显微镜的分辨率可用公式表示为 NA sin u 2 式中 为最小分辨率距离 为光线的波长 NA为物镜的数值孔径 第四章显微镜的光学参数 三 放大率放大率 magnification 也叫放大倍数 是指被检物体经显微镜放大后 人眼所看到的最终图像和原物体大小的比值 显微镜的放大倍数是指对物体长度的放大 显微镜放大率公式 250 f1f2式中 为光学筒长 一般为160mm 250为明视距离 单位为mm f1为物镜的焦距 f2为目镜的焦距 在考虑其总放大倍率的同时 首先应选取所用物镜的放大倍数 其次才考虑目镜的放大倍数 其原因在于显微镜的成像质量主要取决于物镜的分辨率 第四章显微镜的光学参数 四 焦深焦深 depthoffocus 也叫景深或焦点深度 即将显微镜的焦点对准某一物点时 在视野平面纵向厚度中能够清晰分辨出的景物范围 显微镜焦深的计算公式为 D K NA式中 K为常数 约为240 m 为被检物体周围介质的折射率 为总放大率NA为物镜的数值孔径 第四章显微镜的光学参数 五 视场直径视场直径 fieldofview 是指在显微镜观察时所看到的圆形视场的视野范围 视场直径越大 观察物体就越方便 在标准长度镜筒下的视场直径计算方法是 用目镜的视场数FN除以所使用的物镜的放大倍率 FN 1式中 为视野直径 1为物镜放大率FN为视场数 是各制造厂给出的参数 第四章显微镜的光学参数 六 工作距离工作距离 workingdistance 也叫物距 即物镜前透镜的表面到被检物体上表面之间的距离 镜检时 被检物体应处于物镜的一倍到二倍焦距之间 因此 它与焦距是两个概念 平时习惯说的调焦实际上是调节工作距离 载物镜数值孔径一定的条件下 孔径角越大工作距离越短 数值孔径大的高倍物镜 其工作距离通常很小 如40 物镜工作距离不会超过0 6mm 100 油镜的工作距离则不足0 2mm 第四章显微镜的光学参数 七 镜像亮度和视场亮度镜像亮度 mirror imagebrightness 是显微镜的图像亮度的简称 指在显微镜下观察到的景物的明暗程度 视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度 和镜像亮度是两个不同的概念 视场亮度不仅与目镜 物镜有关 它还直接受到聚光镜 光阑和光源等因素的影响 在不更换物镜和目镜的情况下 视场亮度大 镜像亮度也大 在观察和显微摄影时 更重要的是镜像亮度 第五章显微镜的主要光学部件第一节物镜 物镜 objective 是显微镜各组件中最为重要的光学部件 它利用光源使被检物体第一次成像 因而直接影响着成像的质量和各项光学参数 物镜质量的好坏是衡量一台显微镜质量的首要标准 物镜的外表面上一般均标有各种光学参数 比如某物镜外标有 10 0 25 和 160 0 17 它表示该物镜的放大倍数为10 数值孔径是0 25 机械筒长为160mm 要求的盖玻片厚度为0 17mm 第五章显微镜的主要光学部件第一节物镜 根据物镜放大倍率的高低 可将其分为 1 低倍物镜放大率1 5 数值孔径0 04 0 15 2 中倍物镜放大率5 25 数值孔径0 15 0 40 3 高倍物镜放大率25 65 数值孔径0 35 0 95 4 油浸物镜放大率90 100 数值孔径1 25 1 40根据物镜像差校正的程度 又可将物镜分为 消色差物镜 复消色差物镜 半复消色差物镜 平场物镜等 第五章显微镜的主要光学部件第二节目镜 目镜 Eyepiece 的作用是把物镜放大的实像 中间像 再放大一次 并把图像映入观察者的眼中 实质上目镜就是一个放大镜 目镜的结构较物镜简单 一般仅由2 5片透镜分两或三组构成 上端的一组透镜称 接目镜 下端的透镜称 场镜 在目镜镜筒内 目镜的物方焦点平面处装置一金属的光阑称 视场光阑 它的作用是限定有效视场的范围 而舍弃四周的模糊像 显微镜的目镜主要有观察目镜和照相目镜 高眼点目镜显微镜 第五章显微镜的主要光学部件第三节聚光器 1 集光器的效用收集光源光线并集合将其成束 以增强照明亮度 通常由2 3个凸透镜组成 最上面的透镜面为平面 2 物镜的有效镜口率 物镜镜口率 集光器镜口率 2 第五章显微镜的主要光学部件第四节显微镜的照明装置 显微镜的照明法按其照明光束的形式 可分为 透射式照明 和 落射式照明 两大类 透射式照明适用于透明或半透明的被检物体 绝大多数生物显微镜属于此类照明法 落射式照明则适用于非透明的被检物体 透射式照明又可分为中心照明和斜射照明两种形式 中心照明又分为临界照明法和柯勒照明法 5 物镜 4 标本平面 3 聚光镜 2 聚光透镜 1 光源 8 二次灯像 7 物镜 6 标本平面 5 聚光镜 4 孔径光阑 3 视场光圈 2 聚光透镜 1 光源 临界照明法柯勒照明法 落射式照明 1 光源2 聚光透镜3 孔径光阑4 视场光圈5 聚光透镜6 半透膜反射镜7 物镜8 被检物体9 至中间像面光路 第六章显微镜使用的注意事项 1 防湿 防尘2 禁用手直接触摸光学玻璃部分 应用拭镜纸擦试镜头 3 油镜需用清洗液 乙醚 乙醇 7 3 除去香柏油 4 防止震动和暴力5 注意物镜转换原则 使用油镜时应用微调6 不要随意把目镜 物镜抽出 第七章各种显微镜1 暗视野显微镜 dark fieldmicroscope 与明视野显微镜的结构基本相同 只是在集光镜下安装特定挡板 利用被检物的折射光和衍射光形成明亮的图像 主要用途 可分辨0 004um以上的微粒的存在和运动 用于观察物体的运动状态及外部形态 其缺陷在于不能分清内部结构 暗视野显微镜的照明方式 暗视野显微镜下苍白密螺旋体 2 相差显微镜 phasecontrastmicroscope 利用光的干涉现象 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差 从而提高了各种结构间的对比度 使各种结构变得清晰可见 在构造上 相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处 a 环形光阑 annulardiaphragm 位于光源与聚光器之间 作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥 焦聚到标本上 b 相位板 annularphaseplate 在物镜中加了涂有氟化镁的相位板 可将直射光或衍射光的相位推迟1 4 主要用途 观察未经染色的活细胞内如细胞核 线粒体等的动态 相差显微镜 一种介壳虫的染色体 3 荧光显微镜 fluorescencemicroscope 利用人眼不可见的一定波长的紫外线照射被检物体使之受激发后产生可见荧光 而对这类物体进行定性定位研究 但此技术有一定的局限性 比如固定剂常会破坏抗原性 包埋剂常产生自发荧光 许多来自焦平面以外的光使观察到的图像反差和分辨率降低 主要用途 特异蛋白等生物大分子定性及定位 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别 1 照明方式通常为落射式 即光源通过物镜投射于样品上 2 光源为紫外光 波长较短 分辨力高于普通显微镜 3 有两个特殊的滤光片 光源前的用以滤除可见光 目镜和物镜之间的用于滤除紫外线 用以保护人眼 尼康E800荧光DIC显微镜 荧光显微镜照片 微管呈绿色 微丝红色 核蓝色 4 激光共焦点扫描显微镜 confocalscanningmicroscope 用激光作扫描光源 逐点 逐行 逐面快速扫描成像 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜 物镜的焦点即扫描激光的聚焦点 由于激光束的波长较短 共焦激光扫描显微镜的分辨力大约是普通光学显微镜的3倍 系统经一次调焦 扫描限制在样品的一个平面内 调焦深度不一样时 就可以获得样品不同深度层次的图像 这些图像信息通过计算机分析和模拟 就能显示细胞样品的立体结构 主要用途 观察细胞形态和细胞内生化成分的定量分析 光密度统计以及细胞形态的测量 LCSM照片 蓝色为细胞核 绿色为微管 红色为色素颗粒 5 偏光显微镜 Polarizingmicroscope 其光源前有偏振片 起偏器 使进入显微镜的光线为偏振光 镜筒中有检偏器 偏振方向与起偏器垂直 载物台可以旋转 当载物台上放入单折射的物质时 无论如何旋转载物台 由于两个偏振片是垂直的 显微镜里看不到光线 而放入双折射性物质时 由于光线通过这类物质时发生偏转 因此物镜便能检测到这种