药物敏感试验

药物敏感试验 1 药物敏感试验种类药物敏感试验种类 1 1 纸片琼脂扩散法 disc agar diffusion test 常采用 Bauer Kirby 法 1 2 液体稀释法 dilution test 肉汤稀释法 broth dilution 和琼脂稀释法 agar dilution test 肉汤稀释法又包括试管稀释法 tube dilution 和微量稀释法 microdilution 2 应用应用 2 1 纸片琼脂扩散法 纸片琼脂扩散法 2 1 1 术语 敏感 表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌 药物治愈 禁忌症除外 耐药 被测菌株不能被常用剂量所达到的组织内或血液中的 抗生素所抑制 中度敏感 表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在生理 性浓集的部位被抑制 如 内酰胺类药物 中介度 这一范围只是抑菌圈直径介于敏感和耐药之间的缓 冲域 以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误 抑菌圈落入中介度范围 意义不明确 如果没有其他可以替代的药 物 应重复或以稀释法测定 MIC 2 1 2 应用 一般认为药敏结果与临床约有 80 90 合格率 药 敏实验是提供治疗感染性疾病最有力的依据 也可以进行流行病学 调查 了解耐药菌株的耐药机制 此外利用药敏谱可对被检菌株进 行鉴定 2 2 液体稀释法 液体稀释法 dilution test 2 2 1 术语 MIC 最小抑菌浓度 MBC 最小杀菌浓度 MIC50 能抑制 50 的试验菌的最低药物浓度即为该药物对被测 菌的 MIC MIC90 能抑制 90 的试验菌的最低药物浓度即为该药物对被测 菌的 MIC 2 2 2 应用 液体稀释法比较繁琐 一般不作为常规试验 仅在 以下几个方面采用 调查罕见耐药 调查药敏定性试验是敏感但临 床疗效不佳的原因 确定中介度的敏感性 有效的选择二线药 评 价新药 3 影响药敏性试验准确性的因素影响药敏性试验准确性的因素 3 1 细菌的分离培养细菌的分离培养 综合动物的临床发病症状 剔除并避免选用少量杂菌 选取 5 份以上菌落 平板划线于血平板上 或根据实验要求划线于不同的 鉴别培养基 再培养 从而达到分离培养的目的 如常用的肠道菌 的分离选择 S S 琼脂和麦康凯琼脂 3 2 培养基选择培养基选择 培养基成分不同 不但影响着敏感菌株的生长繁殖 并可影响 到抑菌圈的直径 培养基内容物质越高 细菌的繁殖越快 数量越 多 一般细菌如肠道杆菌及葡萄球菌等可用普通营养琼脂 链球菌 巴氏杆菌或肺炎球菌等可用绵羊血琼脂平板 测定磺胺类药物敏感 试验时 应选用无蛋白胨琼脂平板 因为胨能使磺胺失去作用 含 血液成分的血汤 血平板会使金霉素 中药提成制剂的作用减弱 氯化钠琼脂中的钙 镁浓度越高 对链霉素 新霉素抑菌圈越少 为此 操作过程中应注意琼脂平板选取 3 3 琼脂平板中琼脂含量高低及琼脂层厚薄 亦影响抑菌圈大小 为此 浇注时 控制在 2 4mm 以 3mm 为最佳 3 4 器材准备器材准备 药敏试验是利用微生物的方法 所用剂量精确到微克 微升计 算 称量天平 移液器 习惯必须精确 培养箱内光线 温度恒定 所用设备预先消毒 灭菌干燥后备用 3 5 培养时间培养时间 细菌在发育过程中 以对数期繁殖最快 活力最强 后处于衰 弱期 为此 可根据试验的需要 培养时间选择在 18 20 小时为宜 尽量不超过 24 小时 时间越长 细菌逐步衰退 敏感性降低 抑菌 圈直径反应不清晰 3 6 划线划线 将已熔化的琼脂培养基冷却到 60 左右 加入已灭菌的培养平 皿中制成平板 凝固后 挑取筛选培养 10 18 小时的幼龄菌 用接 种环在培养基表面进行熟练划线 如此反复多次不同方向划线 使 整块琼脂表面均匀布满细菌 划线方法很多 可以参照个人习惯选 择应用 但注意 划线要均匀 不要划破培养基 3 7 标准菌样及被检药物标准菌样及被检药物 标准菌样应是来自同一地 同一批饲养动物的样品 被检药物 按预防 治疗剂量分别稀释 且药物在有效期内 无氧化 潮解等 现象 操作时应按相同的方法和相同条件进行 以避免人为因素造 成操作误差 3 8 对照组对照组 培养基 药物试剂和试验方法等的不同 可直接影响试验结果 故每批培养基配置后 均应以阴性及阳性菌株测试 符合要求方可 投入正式使用 对一些反映不够稳定或影响因素甚多试验 需在每 次试验同时 进行阳性和阴性对照试验 如营养琼脂 营养肉汤再 无药量的条件下培养后细菌能正常生长 则判定为阴性 无抑菌作 用 3 9 培养基培养基 pH 值值 酸碱性对实验结果有明显差异 新霉素 链霉素等在碱性环境 中活性强 反之则小 青霉素 氯霉素以中性为佳 沙星类 大环 内酯类以弱酸性环境为宜 3 10 判定时间判定时间 观察抑菌反应结果的时间 根据试验不同的需要 并严格遵守 细菌生化试验观察结果时间要求 多在 24 小时内判定 但要根据实 际情况确定 时间过长过短不能观测到抑菌正确结果 4 药敏试验方法的选择与标准化药敏试验方法的选择与标准化 美国临床实验室标准化委员会 NCCLS 推荐纸片扩散法测抑 菌环直径和肉汤稀释法测 MIC 少数细菌和抗生素要求用琼脂稀释 法 在常规工作中选用纸片扩散法或 MIC 可依本单位情况而定 一 般纸片扩散法较为灵活实用 纸片扩散法 肉汤稀释法及琼脂稀释 法必须标准化 如抗生素浓度 培养基的组分 pH 细菌借种方法 接种量 温育时间 结果判定标准及结果解释等 应该按照 NCCLS2004 年发布的文件 第 14 版 严格执行 常规纸片扩散法 肉汤稀释法只适用于速生细菌 依医疗需要开展的苛养菌 厌氧菌 真菌 分枝杆菌等药敏试验也应遵照 NCCLS 文件的规定进行 5 药敏检测盒 专利 的使用药敏检测盒 专利 的使用 目前 抗生素在养殖中的使用教盲目 不仅造成药物浪费 延 误了最佳治疗时机 而且导致细菌产生强耐药性 因此 应根据药 物敏感试验科学指导用药 传统的药敏试验方法是纸片扩散法 但 是药敏纸片需要专门制作 而且都是单一抗生素 而目前兽医临床 使用的多是复合抗生素 因此 对兽医临床 养殖场以及兽药研发 都起不到指导作用 针对以上问题我们设计了方便 实用的药敏检测盒 该检测盒 的技术方案为 待检测孔的检测盒上盖有检测盒盖 在检测盒底面 上刻有测量刻度 他的优点是 不需要准备药敏纸片 各种临床应 用药物 直接按照试验墓地加入检测孔中即可进行药敏试验 在临 床应用上具有操作简便 药效快速 高效 准确 成本低的优点 广泛适用于兽药研发和养殖场高效抗生素的筛选 指导临床用药 提高治疗效果 具体使用说明如下 1 取无菌检测盒 检准备好的试验用药物 按照实验目的用量 加入检测孔 最高体积不超过 20 微升 2 在加好药物的检测孔中加入 1 滴试验用培养基 液态 最 高体积不超过 20 微升 3 将试验用培养基倾注于检测盒中 以 2 4mm 厚为宜 水平 放置 待其凝固 4 将试验用细菌 纯培养的或混合培养的 均匀涂布于凝固了 的培养基表面