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几种基本蛋白质实验技术 SDS PAGEWesternblottingSouthwesternblottingImmunochemistry SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理 根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分 1 制备凝胶试剂 丙烯酰胺 单体 亚甲双丙烯酰胺 胶联剂 二者比例29 1母液浓度30 过硫酸铵 引发剂 N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 加速剂 十二烷基磺酸钠 SDS 阴离子变性剂 SDS PAGE试剂 2 蛋白上样缓冲液3 电泳缓冲液4 考马斯亮蓝R250染色液5 脱色液 SDS PAGE实验过程流程如下 凝胶制备蛋白样品制备及上样电泳卸胶染色脱色 凝胶制备 梳子孔 分离胶 浓缩胶 分子量范围与凝胶浓度 分子量范围 KDa 凝胶浓度范围 1004 7 10 100K8 15 1020 30 12 SDS PAGE凝胶成分 15ml 试剂及浓度12 分离胶纯水4 9ml30 丙烯酰胺6 0ml1 5MTris Cl pH8 8 3 8ml10 SDS150ul10 过硫酸胺150ulTEMED4ul 5 SDS PAGE凝胶成分 6ml 试剂及浓度5 浓缩胶纯水4 2ml30 丙烯酰胺0 99ml1 0MTris Cl pH6 8 0 75ml10 SDS60ul10 过硫酸胺30ulTEMED3ul 蛋白样品制备及上样 每个加样孔所上样蛋白总量要适中过高 蛋白条带扭曲过低 蛋白条带染色浅蛋白样品需与上样缓冲液混合 1 1 2 SDS凝胶上样缓冲液 100mM LTris Cl pH6 8 200mM LDTT 4 SDS 0 2 溴酚蓝 20 甘油 上样前样品需要沸煮3 5分钟 电泳 上层胶电压小 80V 使蛋白在浓缩胶和分离胶的交界处浓缩呈线状下层胶电压加大 150V 使蛋白样品充分分开 卸胶 防止凝胶破损染色 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝R2501 25g 甲醇225ml 冰醋酸50ml MilliQ水定容500ml 脱色 甲醇150ml 冰醋酸50ml MilliQ水300ml Westernblotting 基本原理 将SDS PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜 nitrocellulosemembrane 上 在膜上进行固相免疫化学染色 原位显示蛋白质带 从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性 定量分析 Westernblotting实验过程流程如下 SDS PAGE 不经染色 电场转移免疫化学染色 电场转移 切下需转移凝胶 再剪下一块与凝胶块等大的硝酸纤维素膜和两块厚滤纸 均浸泡于电转移缓冲液中 25mMTris 192mMglycine 0 1 SDS 20 甲醇 至少30分钟 然后用塑料框架固定如 三明治 样 凝胶 NCM 滤纸 固定架 SDS 蛋白质复合物在电场的作用下向正极移动 达到NCM 以共价键结合在NCM上 根据目的蛋白分子量大小设定电流 恒流 或电压 恒压 大小 电转移操作时应注意 凝胶 NCM及滤纸一定要在电转移缓冲液中浸泡 凝胶 NCM及滤纸大小应一致 以防电转时短路 半干转时 一定要赶走 三明治 各层间的气泡 电转移缓冲液中的甲醇 可促进蛋白质与NCM的结合 最好用前加入 转移完成后 可用丽春红染NCM 观察转移的效果 同时 转膜后的凝胶也可以进行银染或者考染 评价转移的效果 最好是NCM上可见 凝胶上模糊 丽春红染色NCM 2 DE 银染转膜后的凝胶 2 DE 免疫化学染色 试剂 TBS 100mmolTris 150mmolNacl 复性液 0 3 TritonX 100于TBS中 封闭液 5 脱脂奶粉于TBS中 TBST漂洗液 0 05 TWeen 20于TBS中 免疫化学染色过程 复性把硝酸纤维素膜放入复性液中 复性5min后 Milli Q水冲洗两遍 封闭把复性过的硝酸纤维素膜放入封闭液 平放于摇床上室温孵育1 2小时 或4 放置过夜 洗涤弃去封闭液 用TBST洗涤3次 10min 次 一抗孵育一抗与封闭液按比例混匀后 移至塑料袋中 将硝酸纤维素膜放入其中 密封塑料袋 于摇床上室温温育2小时 洗涤TBST充分3 4次 10min 次 二抗孵育将辣根过氧化物酶二抗用封闭液稀释后 将硝酸纤维素膜加入其中 室温摇床上放置2小时 洗涤TBST充分3 4次 10min 次 DAB显色将二抗孵育后的硝酸纤维素膜放入显色液中 轻轻摇动3 10min 待膜上可见明显的显色斑点 Southwesternblotting 该方法是结合了Westernblotting和southernblotting两种试验方法而发展起来的检测与特异DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法 基本原理 细胞核蛋白提取物经SDS PAGE后 转移至NCM上 然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质 Southwesternblotting实验过程流程如下 SDS PAGE电场转移标记的DNA探针与NCM上蛋白质的杂交 Immunochemistry 基本原理 应用抗原与抗体结合的免疫学原理 检测细胞或组织中多肽 蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布 组织固定 石蜡包埋 切片 脱蜡过氧化氢灭活内源性过氧化物酶微波修复抗原封闭一抗 二抗孵育孵育DAB显色苏木素 伊红 HE 复染 免疫组化法一般实验过程 Keypoints