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第五章中药制剂中各类化学成分分析 原忠 第二节黄酮类成分分析 一 概述黄酮类化合物 flavonoids 在植物体内大部分与糖结合成苷 一部分以游离形式存在 黄酮类化合物最集中的是被子植物 类型最全 结构最复杂 含量也高 由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见 槲皮素 quercetin 黄芩苷 baicalin 橙皮苷 hesperidin 葛根素 Puerarin 淫羊藿苷 Icarin 二 结构特征及理化性质 一 结构特征多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系 故在200 400nm波长区域内有强烈的吸收带 此是光谱法及色谱 光谱法分析的基础 大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基 可与聚酰胺形成氢键 可用聚酰胺色谱法进行分析 2 溶解度游离苷元难溶或不溶于水 易溶于甲醇 乙醇 乙酸乙酯 乙醚等有机溶剂及稀碱液中 黄酮苷一般易溶于水 甲醇 乙醇等强极性溶剂中 但难溶或不溶于苯 氯仿等 二 理化性质 3 酸碱性酸性 黄酮类化合物因分子中多有酚羟基 故显酸性 可溶于碱性水溶液 吡啶 甲酰胺及二甲基甲酰胺中 碱性氧原子的性质黄酮类化合物分子中 吡喃酮环上的1 位氧原子 因有未共用的电子对 故表现出微弱的碱性 可与强无机酸 如浓硫酸 盐酸等生成盐 常表现出特殊的颜色 可用于鉴别 生成的盐极不稳定 加水后即可分解 4 显色反应还原反应 与盐酸 镁粉 或锌粉 反应 金属盐类试剂的络合反应 黄酮类化合物分子中多有下列结构 故常可与铝盐 铅盐 锆盐 镁盐等试剂反应 生成有色络合物 铝盐 常用试剂为1 三氯化铝或硝酸铝溶液 生成的络合物多为黄色 max 415nm 并有荧光 可用于定性及定量分析 铅盐 常用1 醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液 可生成黄至红色沉淀 据此不仅可用于鉴定 也可用于提取及分离工作 锆盐 多用2 二氯氧化锆甲醇溶液 黄酮类化合物分子中有游离的3 或5 OH存在时 均可反应生成黄色的锆络合物 但两种锆络合物对酸的稳定性不同 当反应液中接着加入枸橼酸后 5 羟基黄酮的黄色溶液显著褪色 而3 羟基黄酮溶液的呈鲜黄色 锆 枸橼酸反应 5 紫外光谱特征黄酮类由于具有2 苯基色原酮的基本结构 具有特定的紫外吸收峰 常有两个较强的吸收带 I带在300 400nm范围内 它是由于B环桂皮酰基引起的 带为240 285nm范围内 它是由于A环上的苯甲酰基引起的 黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠 醋酸钠 氯化铝等 可使最大吸收波长发生位移 选择性提高 还可消除杂质的干扰 有利于含量测定 三 定性鉴别 一 显色反应黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及 吡喃酮环有关 常用盐酸 镁粉 或锌粉 反应与金属盐类试剂的配合反应黄酮类化合物分子中有游离的3 OH 5 OH或邻二酚羟基时可与Al3 Zr4 Pb2 Sr2 等形成络合物 这些络合物有的产生荧光或颜色加深 如Al3 Zr4 有的产生沉淀 如Pb2 Sr2 二 色谱鉴别吸附剂 硅胶 聚酰胺 硅胶色谱分离弱极性化合物较好 聚酰胺色谱分离含游离酚羟基的黄酮及其苷为佳 纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物 显色反应 采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法 实例二陈丸中橙皮苷的鉴别供试品取本品5g 加甲醇30ml 置水浴上加热回流30分钟 滤过 滤液浓缩至约5ml 作为供试品溶液 对照品橙皮苷对照品 加甲醇制成饱和溶液 为对照品溶液 展开吸取上述两种溶液各2 l 分别点于同一用0 5 氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上 以醋酸乙酯 甲酸 水 100 17 13 为展开剂展开 展距约3cm 取出 晾干 再以甲苯 醋酸乙酯 甲酸 水 20 10 1 1 的上层溶液为展开剂 展开 展距约8cm 取出晾干 显色喷以三氯化铝试液 置于紫外灯下 365nm 检视 四 黄酮类成分定量分析总黄酮含量 黄酮类单体成分的含量或二者同时测定 直接测定 黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰 含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经一定的提取纯化后 可直接于最大吸收波长处测定其吸收度 以芦丁等为对照品计算其含量 显色测定 黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸收波长差别较大 可消除背景 即阴性空白 的干扰 以提高本法的选择性及灵敏度 常用铝盐作显色试剂 二 黄酮类单体成分的含量测定1 薄层色谱法样品经有机溶剂或水提取后 可用硅胶 纤维素或聚酰胺进行层析 达到分离目的 层析后可将含有待测组分的色斑刮下 再用适当的溶剂洗脱后 用紫外 可见分光光度法测定 更常用的是薄层扫描仪 单波长或双波长法 直接在薄层板上扫描测定 2 高效液相色谱法由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸收 使用HPLC法检测灵敏度较高 故该法在黄酮类单体成分的定量分析中最常用 黄酮类成分的HPLC条件他为正相和反相色谱两类 反相色谱应用较多 反相色谱测定多有C18键合相固定液 流动相常用甲醇 水 乙酸 或磷酸缓冲液 及乙腈 水 检测器主要采用紫外检测器或荧光检测器 藿香正气片橙皮苷的测定 HPLCphotogramsofhesperidinA 对照品溶液 B 阴性样品溶液 C 供试品溶液 对投料陈皮 依据 中华人民共和国药典 陈皮项下要求 以干燥品计 橙皮苷的含量不得小于3 5 结合法定标准和实际测定值以及上述分析 规定本品含橙皮苷的限度为不小于0 8mg 片 1 采用正相HPLC法测定黄酮类成分 固定相选择A 硅胶B C18C C8D 氰基键合相硅胶E 氨基键合相硅胶 2 采用光光度法测定总黄酮含量时 常用的显色剂有A 三氯化铝B 硝酸铝C 亚硝酸钠 硝酸铝D 醋酸钾 三氯化铝E 盐酸 镁粉 3 薄层色谱检识黄酮类成分时 常用的方法有A 硅胶薄层色谱B 氧化铝薄层色谱C 聚酰胺薄层色谱D 纤维素薄层色谱E 纸色谱 4 黄酮类化合物常用的定性鉴别反应有A 盐酸 镁粉反应B 四氢硼钠反应C 二氯氧锆反应D 三氯化铝反应E 硝酸铝反应 5 采用高效液相色谱法测定黄酮类成分含量时 常用检测器有A 紫外检测器B 荧光检测器C 蒸发光散射检测器D 示差检测器E 氢焰离子化检测器 1 2000年版 中国药典 中黄芩以 葛根以 淫羊藿以 为对照品进行含量测定 2 大多数黄酮结构中存在有 和 组成的交叉共轭体系 故有 吸收 3 中药制剂中单体黄酮类化合物的含量测定常用的色谱法是 和 测定时常随行已知量的对照品 该测定方法称 法 4 用可见 紫外分光光度法测定中药制剂中总黄酮类成分含量时 既可以利用 直接于 max处测定吸收度 也可以利用 后进行测定 常用的对照品是 5 醋酸钾 三氯化铝试剂与黄酮类显色后其 max为 亚硝酸钠 硝酸铝试剂与黄酮类显色后其 max为 试述复方制剂中黄酮类成分的硅胶薄层条件 答案 进行二次展开 可有效的增大黄酮类成分在硅胶G板上的分离度 二次展开时 第一次展开用的展开剂极性强 展开后须将薄层板上的溶剂完全挥干 三氯化铝显色检识荧光 有效的增大其检测的灵敏度 某些黄酮类化合物可与铝盐 铅盐 锆盐 镁盐等试剂发生配合反应 生成有色络合物 2 一清颗粒中黄芩苷HPLC测定法中系统适用性试验为 用十八烷基键合硅胶为填充剂 甲醇 0 2mol L磷酸二氢钠缓冲液 用磷酸调节pH至2 7 42 58 为流动相 检测波长为275nm 理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000 与相邻峰的分离度应符合要求 0 5mg ml黄芩苷对照品溶液重复进样 10 l 峰面积分别为768369 760924 771283 771069 769450 写出理论板数与分离度的计算式 柱长为25cm 理论板高不低于多少 计算重复进样的相对标准偏差 其值的意义是什么 答案 n 5 54 tR 1 2 2 R tR2 tR1 1 2 2 H 25 5000 0 05mm RSD 0 55 注射用双黄连中黄芩苷的鉴别及HPLC测定方法要点 1鉴别 供试品溶液的制备 取本品用适量甲醇溶解 作为供试品溶液对照品 黄芩苷薄层色谱条件 聚酰胺薄层板 展开剂 醋酸 显色剂 紫外灯下检视 供试品色谱中 在于对照品色谱相应的位置上 显相同颜色的点 2含量测定 色谱条件 反相C18柱 流动相 甲醇 水 冰醋酸 检测波长 274nm 供试品溶液的制备 精密量取本品加甲醇使溶解 溶液稀释至刻度 摇匀 即得 对照品溶液 取黄芩苷对照品适量 精密称定 加甲醇制成的溶液 即得 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 1 注入液相色谱仪 测定 即得 第三节蒽醌类成分分析 一 概述中药中醌类化合物主要有苯醌 萘醌 菲醌和蒽醌四种类型 其中以蒽醌类化合物最为多见 包括蒽醌及其不同还原程度的产物和二聚物 如蒽酚 氧化蒽酚 蒽酮 二蒽酮 二蒽醌等 这些化合物在中药中可游离存在 也可与糖结合成苷 称为蒽苷 1 萘醌类萘醌化合物从结构上考虑可以有 1 4 1 2 及amphi 2 6 三种类型 但迄今为止从自然界得到的几乎均为 萘醌类 1 4 萘醌 1 2 萘醌amphi 2 6 萘醌 二 结构特征及理化性质 紫草素 shikonin 和异紫草素 alkanin 2 菲醌类天然菲醌衍生物包括邻醌 A 及对醌 B 两种类型 A B 丹参酮IIA tanshinoneIIA 3 蒽醌类蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物 如氧化蒽酚 蒽酚 蒽酮及蒽酮的二聚物等 蒽醌氧化蒽酚蒽酮蒽酚 sennoside 理化性质1 溶解性苯醌及萘醌多以游离状态存在 而蒽醌类则往往结合成苷存在于植物体中 游离的醌类多具有升华性 小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性 能随水蒸气蒸馏 可据此进行提取 精制工作 游离醌类多溶于乙醇 乙醚 苯 氯仿等有机溶剂 微溶于或不溶于水 结合成苷后极性增大 易溶于甲醇 乙醇中 在热水中也可溶解 几乎不溶于乙醚 苯 氯仿等非极性溶剂中 2 酸碱性蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基 故具有一定酸性 在碱性水溶液中易溶 但加酸酸化时又可重新沉淀析出 所谓碱提取 酸沉淀即是根据这个道理进行的 根据以上性质 醌类化合物的提取可采用碱提取 酸沉淀法 3 显色反应醌类的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚羟基的性质 碱性条件下的呈色反应 羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起颜色改变并加深 与金属离子的反应 在蒽醌类化合物结构中 如果有 酚羟基或具有邻位二酚羟基时 则可与Pb2 Mg2 等金属离子形成络合物 与Pb2 形成的络合物在一定pH条件下能沉淀析出 故可用于该化合物的精制 与对亚硝基二甲基苯胺反应 9位或10位未取代的羟基蒽酮类化合物 尤其是1 8 二羟基衍生物 酮基对位的亚甲基上的氢很活泼 可与对亚硝基二甲基苯胺反应 缩合产生各种颜色 三 定性鉴别1 显色反应将中药制剂用适当方法提取分离 制成供试品液 利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对羟基蒽醌类成分进行鉴别 2 升华法 游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性中药制剂中如含有这类成分量较大 可采用升华法 得到升华物可见光下观察或加碱性试液显色定性 如大黄流浸膏的鉴别 刮去糖衣 研细 取滤液5ml 加乙醇10ml 温热10分钟 滤过 加镁粉少量 与盐酸0 5ml 加热 显红色 红色消褪 变为黄色 加氢氧化钠试液 显红色 加酸成酸性时 取牛黄解毒片中黄芩和大黄的鉴别 3 薄层鉴别1 吸附剂 多用硅胶2 展开剂 A 乙酸乙酯 甲醇 水 100 16 5 13 5或相近的比例 适于他离蒽醌苷元和蒽醌苷 B 正丙醇 乙酸乙酯 水 4 4 3 和异丙醇 乙酸乙酯 水 9 9 4 适于分离番泻苷和二蒽酮苷C 不含水或甲醇的混合溶媒适合于他离蒽醌类的苷元 3 显色方法 主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液 氨气熏及在紫外灯下观察荧光 亦可在可见光下直接观察色斑 四 含量测定1 游离蒽醌的测定中药中含有游离蒽醌的量一般不高 且为脂溶性的 故此部分另用弱极性溶剂如乙醚 氯仿等提取后加碱比色测定 2 结合蒽醌的测定 通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出 水解成苷元后再测定 将药渣先行酸水解 然后用非极性溶剂提取苷元后测定取待测样品先行酸水解 然后用非极性溶剂提取苷元后测定 其结果为总蒽醌含量 从中减去游离蒽醌含量 即得结合蒽醌的含量 3 蒽醌类单体成分的测定中药制剂中蒽醌类单体成分的测定方法主要有薄层扫描法和高效液相色谱法 薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法 经层析分离后 可在可见光 紫外光及荧光下扫描测定 蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收 利用高效液相色谱 紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分 具有灵敏 准确 简便等特点 1 醌类化合物的理化性质为A 无色结晶B 有色固体C 游离醌类多有升华性D 小分子苯醌 苯醌有挥发性 能随水蒸气蒸馏E 游离蒽醌有挥发性 能随水蒸气蒸馏 2 大黄酸对照品理化性质描述正确的是A 易升华B 黄色针状结晶体C 易溶于甲醇 乙醇D 几乎不溶于水E 易溶于碱和吡啶 3 含蒽醌类化合物制剂的鉴别可用A 升华法B 氢氧化钠溶液显色C 薄层色谱法D 硫酸溶液显色E 三氯化铝溶液显色 4 蒽醌类化合物理化性质描述正确的为A 多呈黄 橙 棕红色等B 均有升华性C 羟基蒽醌类在碱性溶液中发生颜色改变D 大多在碱性水溶液中易溶 加酸重新析出E 易溶于甲醇 氯仿中 5 专用于检识苯醌和萘醌 蒽醌类不发生反应的是A 无色亚甲蓝B Borntrager反应C 醋酸镁D Feigel反应E 以上均可 6 制剂中总蒽醌含量测定操作正确的是A 取样 氯仿提取 混合碱液显色 测定B 取样 酸水解 氯仿提取 混合碱液显色 测定C 取样 甲醇提取 混合碱液显色 测定D 取样 水提取 混合碱液显色 测定E 取样 甲醇提取 测定 1 制剂中游离和结合蒽醌含量测定时常用的显色剂为 或 2 制剂中游离和结合蒽醌比色法含量测定时常用对照品为 3 对亚硝基二甲苯胺反应可用作 化合物的定性鉴别反应 第四节三萜皂苷类成分分析 一 概述三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物 大多数三萜化合物均可看作由6个异戊二烯单位联结而成 游离三萜类化合物通常多不溶于水 而与糖结合成苷后 则大多可溶于水 振摇后可生成胶体溶液 并有持久性似肥皂溶液的泡沫 故有三萜皂苷之称 三萜皂苷和甾体皂苷 柴胡皂苷a 黄芪甲苷 人参皂苷Rh2 人参皂苷Rh1 人参皂苷Rg3 人参皂苷Rg1 人参皂苷Re 酸水解产生 20 R 原人参二醇或20 R 原人参三醇 然后侧链再发生环合 二 理化性质溶解度可溶于水 易溶于热水 含水稀醇 热甲醇和热乙醇中 几乎不溶于或难溶于乙醚 苯等极性小的有机溶剂 在含水丁醇或戊醇中溶解度较好 且又能与水分成二相 可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇提取皂苷 借以与亲水性的糖 蛋白质等分离 三萜皂苷元能溶于石油醚 苯 乙醚 氯仿等有机溶剂 而不溶于水 显色反应醋酐 浓硫酸反应 Liebermann Burchard反应 五氯化锑反应 Kahlenberg反应 三氯醋酸反应 Rosen Heimer反应 冰醋酸 乙酰氯反应 Tschugaeff反应 氯仿 浓硫酸反应 Salkowski反应 三 定性鉴别 理化鉴别泡沫反应 多用于检验含有皂苷的原料药 化学显色反应 仅在组成药物较少的中药制剂中使用 薄层色谱法由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收 故经薄层色谱分离 然后选用适当的显色剂显色观察 是皂苷定性鉴别中最常用的方法 三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附剂 也有采用氧化铝 硅藻土等为吸附剂 薄层层析后 可选用三氯醋酸 氯磺酸 醋酸 50 及10 硫酸乙醇液 三氯化锑 磷钼酸 浓硫酸 醋酸酐 碘蒸气等显色剂进行显色 其中以不同浓度的硫酸乙醇液为最常用 供试液制备 样品可用甲醇提取后直接进样分析 如重楼 用三氯甲烷脱脂再用水饱和的正丁醇提取 提取液蒸干 残渣甲醇溶解后进样分析 如人参 甲醇提取 回收甲醇 残渣用水饱和的正丁醇萃取 萃取液回收正丁醇 样品上D101大孔吸附树脂柱 水洗后再用不同浓度的乙醇溶液洗脱 收集含皂苷部分 回收乙醇 残渣用甲醇溶解进样分析 如黄芪 复方丹参片的薄层色谱图1 2阴性对照3 4 5 6三七对照药材7三七皂苷对照品8人参皂苷Rb1对照品9人参皂苷Rg1对照品10 11 12 13 14供试品 取本品5g 加等量硅藻土研匀 用7 硫酸的45 乙醇溶液 充分研磨 提取3次 每次15ml 离心 取上清液 置雏形瓶中置水浴上回流1小时 冷却 用石油醚提取3次 每次15ml 合并提取液 加水1Oml洗液 石油醚液挥干 残渣加甲醇溶解 使成0 5ml 作为供试品溶液 取人参二醇 人参三醇对照品 加甲醇制成每1ml含1mg的混合溶液 作为对照品溶液 薄层板 硅胶G加0 3 羧甲基纤维素钠水溶液的自制板 展开剂 苯 醋酸乙酯 3 2 显色 喷以硫酸乙醇溶液 3 10 在105 加热数分钟至斑点显色清晰后 置紫外光灯 365nm 下检视 1 4 龟龄集5 人参二醇 人参三醇 1 12 一捻金13 人参二醇 人参三醇 1 4 定坤丹5 人参二醇 人参三醇 四 三萜皂苷类成分的定量分析中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂苷测定 皂苷元测定和单体皂苷测定 一 总皂苷的含量测定1 提取分离总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取 由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大 因此提取溶剂可为各种浓度的甲醇 70 95 乙醇 异丙醇 丁醇 戊醇 提取后经分离得到总皂苷成分 分离可用有机溶剂 如水饱和的正丁醇萃取 也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱 2 测定方法重量法该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制 在中药制剂中 如处方中药味含皂苷类成分较多时 常用正丁醇作溶剂 测定正丁醇浸出物 比色法常用三萜皂苷显色剂有香草醛 硫酸 香草醛 高氯酸 醋酐 硫酸 高氯酸 浓硫酸以及亚甲蓝等 用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含量时 可选用单体皂苷或皂苷元作对照品 但要注意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数 二 皂苷元的含量测定皂苷元的获得 得到总皂苷后 加酸 如硫酸 盐酸 加热水解 得到皂苷元 将样品先行水解 再用有机溶剂从水解后的溶液中提取皂苷元 测定方法 主要有薄层色谱法 高效液相色谱法和比色法 三 三萜皂苷类单体成分含量测定1 薄层色谱法样品经适当的提取 纯化后 用薄层色谱法分离 可排除其他组分的干扰 常用于测定中药制剂中的皂苷元或单体皂苷 定量方法可采用薄层洗脱 比色法或薄层扫描法 2 高效液相色谱法大多数三萜皂苷类成分 如人参皂苷 三七皂苷等可利用其在紫外区的末端吸收来检测 但灵敏度相对要低 若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的紫外吸收 如甘草酸 远志皂苷等 可用HPLC分离并用紫外检测器检测 蒸发光散射检测器 ELSD 用于高效液相色谱法检测三萜皂苷类成分的应用日渐广泛 甘草酸 三七皂苷R1 ELSD 色谱柱 ZorbaxSB C18 250 4 6mm 5 0 m 柱温 25 流动相 A乙腈 醋酸 95 0 5 B0 5 醋酸 梯度洗脱 29 A 0 10min 29 46 A 10 25min 46 A 25 30min 检测器 蒸发光散射检测器 漂移管温度 106 氮气流速 2 6L min 1 皂苷常见显色反应有A 盐酸 镁粉反应B 中和反应C 醋酐 浓硫酸反应D 五氯化锑反应E 冰醋酸 乙酰氯反应 2 有关三萜皂苷单体成分定量分析描述正确的是A 人参皂苷等在紫外区有强吸收 HPLC UV检测灵敏度高B 三七皂苷等在紫外区仅有末端吸收 HPLC UV检测灵敏度差C HPLC ELSD检测器检测人参 三七皂苷基线稳定 重现性和灵敏度较好D 远志皂苷在紫外区有强吸收 HPLC UV检测灵敏度高E 甘草皂苷在紫外区无吸收 HPLC UV检测灵敏度低 3 采用可见 紫外分光光度法测定总皂苷含量