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文档简介

PolymeraseChainReaction PCR 多聚酶链式反应技术 1 以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 2 3 核酸模板 引物 反应缓冲系统 TaqDNA聚合酶 4种dNTP Mg2 包括Tris HCl 维持PH值 KCl 利于引物的退火 Taq聚合酶保护剂 PCR的特异性 3 端和5 端 18 25bp 0 1 0 5 M Tm值 4种碱基随机分布 自身避免反向重复序列 引物之间不存在互补序列 3 端选择保守的氨基酸序列 与非特异性序列的同源性 PCR的合成原料 四种dNTP浓度应相等 耐高温 在热变性时不会被钝化 使DNA聚合酶具有催化活性 DNA RNA 线性 小片段模板 核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子 4 实验参数设置 变性的温度与时间退火的温度与时间延伸的温度与时间循环数 5 PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳 EB 它能和碱基间的氢键结合 在波长为254nm 365nm的紫外光照射下呈橘红色 530nm 的荧光 琼脂糖凝胶板的制备 1 5 加样电泳 电压80V 时间2hr 紫外 6 PCR技术 巢式PCR 原位PCR 多重PCR 定量PCR 逆转录PCR 7 逆转录PCR 相对于基本PCR 在开始阶段增加步骤 RNA cDNA合成 是单链到双链的过程 引物 逆转录酶 RNA水解酶 8 RealTimeqPCR 荧光嵌合法 TBGreen 荧光探针法 实时荧光定量PCR技术 Real TimeQuantitativePCR 是指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 9 基线 Baseline 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里 荧光信号变化不大 接近一条直线 这样的直线即基线 光阈值 threshold 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值是PCR3 15个循环荧光信号标准差的10倍 荧光域值设定在PCR扩增的指数期Ct Cyclethreshold 值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 RealTimeqPCR 10 固定循环数后 荧光信号与模板数成正比 初始DNA量越多 荧光达到阈值时所需要的循环数 Ct值 越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系 根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 RealTimeqPCR 熔解曲线 确认PCR反应的特异性 Ct值无数值 undetected 阴性Ct值 30 0阳性Ct值 30 0表达量极少 11 RealTimeqPCR 相对定量法分析结果 内参 管家基因 GAPDH actin 18SrRNA ACTB 2M 至少选择两个以上 R 2 Ct
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