DOPAIGF1改性可降解聚合物材料用于神经组织工程的研究

DOPAIGF1DOPAIGF1改性可降解聚合物材料用于神经组织工程的研究改性可降解聚合物材料用于神经组织工程的研究 DOPA IGF 1改性可降解聚合物材料用于神经组织工程的研究A NovelApproach viaSurface Modificationof DegradablePolymers withAdhesive DOPA IGF 1for NeuralTissue Engineering作者姓名张逸专业名称外科学研究方向神经组织工程指 导教师杨小玉教授学位类别医学博士培养单位吉林大学第二医院论 文答辩日期年月日授予学位日期年月日答辩委员会组成姓名职称工 作单位主席陈学思研究员中国科学院长春应用化学研究所委员曾宪 录教授东北师范大学王金成教授吉林大学第二医院张桂珍教授吉林 大学第二医院刘钦毅教授吉林大学第二医院I中文摘要DOPA IGF 1改性可降解聚合物材料用于神经组织工程的研究据美国国立脊髓损 伤统计中心 NSCISC 统计 全世界每年新增脊髓损伤患者40例 百 万人口 大多数是由于交通事故引起 其次为暴力创伤 高处坠落 和运动创伤 脊髓损伤预后不理想和其复杂的微环境密切相关 促进神经元和轴突的生长需要多种因素干预 主要是减少胶质瘢痕 和炎性因子的形成 并且维持生长因子持久的作用 为了解决这一问题 神经组织工程学近年来逐渐受到关注 合成高分子材料PLGA因降解速率和理化性能的高度可控性 被视为 神经组织工程中最有前景的合成高分子材料 但PLGA在亲水性和组织相容性方面不具有优势 因此如何提高PLGA材料表面的生物活性是目前需要解决的难题 神经组织支架通过担载生长因子或者种子细胞植入受损的脊髓 修 饰后的支架能促进神经再生和相关功能的恢复 前期工作中我们重组制备了DOPA IGF 1 当调节pH 8 5时 DOPA中邻苯二酚基团的氧化导致化学交联 在 钛金属表面形成一层IGF 1蛋白膜 并能明显促进NIH3T3细胞的增殖和黏附 IGF 1是由70个氨基酸组成的多肽 在神经系统中 IGF 1具有促神经元的再生 神经突触的生长 促进细胞增殖和抑制神经 元凋亡等作用 IGF 1也能促进间充质干细胞的增殖 迁移 生物活性分子分泌和分化 因此我们提出将DOPA IGF 1修饰在PLGA材料表面以提高其生物活性 为脊髓损伤修复提供具有 功能性的生物材料 目的1将DOPA IGF 1在PLGA表面进行修饰制备DOPA IGF 1 PLGA膜 与cIGF 1对比 观察DOPA IGF 1改性后的PLGA材料对hUCMSCs生物学活性的影响 2将hUCMSCs搭载在DOPA IGF 1 PLGA膜上 制备DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜 观察其在大鼠脊髓损伤修复中的作用 方法1通过SDS PAGE和western blot验证制备的目的蛋白YKYKY IGF 1 Y IGF 1 之后酪氨酸酶羟化反应将Y羟化成DOPA得到DOPA IGF 1 通过IIELISA实验对比cIGF 1 Y IGF 1和DOPA IGF 1在PLGA表面蛋白绑定能力 绑定量的差异 AFM XPS和接触角检测 观察DOPA IGF 1 PLGA膜表面理化性能的改变 2对比cIGF 1 Y IGF 1 DOPA IGF 1修饰的PLGA膜对hUCMSCs生物学功能的差异 通过CCK 8观测hUCMSCs增殖并确定作用的最佳浓度 鬼笔环肽染色观测细胞的黏附和生长状态 通过qRT PCR和western blot实验检测hUCMSCs在不同PLGA膜上生长因子相关基因的表达和旁 分泌能力 3PC12细胞培养验证hUCMSCs旁分泌物质的功能性 使用离心后去细胞的hUCMSCs培养基培养PC12细胞 通过光镜大体观测和ImageJ定量分析两种方法检测PC12细胞在去细 胞培养基 CM 中轴突的生长情况 通过qRT PCR法检测PC12细胞分化的相关基因表达 4Transwell培养法将DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs和PC12细胞共培养 观测DOPA IGF 1和hUCMSCs之间协同作用效果 通过光镜大体观测和ImageJ定量分析两种方法检测PC12细胞轴突的 生长情况 通过免疫荧光MAP2染色观测PC12细胞的分化情况 5建立大鼠脊髓半切损伤模型 进一步验证DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜上DOPA IGF 1和hUCMSCs协同效应对脊髓损伤修复的作用 通过运动学BBB评分和肌电图分别在运动功能和神经电生理学两方面 进行评价 通过HE染色在组织学上观察损伤脊髓的恢复情况 通过免疫荧光观察DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜促进神经元再生情况 结果1本研究通过大肠杆菌的扩增 表达和纯化得到了Y IGF 1目的蛋白 通过酪氨酸酶的羟化反应得到黏附性生长因子DOPA IGF 1 将PLGA膜在cIGF 1 Y IGF 1 DOPA IGF 1蛋白液中分别孵育12h 通过ELISA实验 AFM和XPS表征充分证实了 含DOPA分子的DOPA IGF 1有效绑定在PLGA材料表面 并且修饰后的PLGA膜表面蛋白含量增加 粗糙程度增加 接触角测试了DOPA IGF 1 PLGA膜表面的亲水性 提示DOPA IGF 1修饰后的PLGA膜表面亲水性增加 2细胞实验对比cIGF 1 Y IGF 1 DOPA IGF 1修饰的PLGA膜对hUCMSCs III生物学功能的影响 通过CCK 8我们发现 在50ng mL时DOPA IGF 1 PLGA对hUCMSCs增殖效果最明显 鬼笔环肽染色观察到细胞均匀黏附在膜表面生长 基因表达结果提示在DOPA IGF 1 PLGA膜上培养的hUCMSCs细胞NGF BDNF和VEGF表达量增高 weste rn blot实验证实DOPA IGF 1 PLGA膜促进了hUCMSCs的NGF蛋白表达和旁分泌功能 3我们用PC12细胞检测hUCMSCs在不同培养条件下旁分泌功能的差异 各组培养基离心去细胞后培养PC12细胞 通过光镜 ImageJ和PC12轴突相关基因的表达进一步说明了DOPA IGF 1 PLGA膜促进了hUCMSCs的旁分泌效应 并且hUCMSCs分泌到培养液 中的生长因子促进了PC12细胞神经突触的生长和分化 4我们通过体外细胞实验探讨生长因子和种子细胞双重修饰的DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜协同生物学效应 为DOPA IGF 1和hUCMSCs的联合协同作用做初步探索 经过PC12细胞轴突生长情况观测和免疫荧光相应抗体检测发现DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜作用的有效性和持续性均强于其他实验组 5通过大鼠脊髓半切动物实验将DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜植入大鼠脊髓损伤部位 通过运动学BBB评分和肌电图结果 我们发现DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜促进了大鼠运动功能的恢复和神经电信号的传导 通过HE染色和免疫荧光染色 我们发现DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜促进了神经元的生长 降低了炎症反应 调节了 损伤局部微环境 结论1DOPA IGF 1在PLGA膜表面的蛋白结合量明显多于商品化IGF 1和未羟化的Y IGF 1 此改性方式提高了PLGA膜表面生物相容性 并且DOPA IGF 1 PLGA膜明显提高了hUCMSCs的生物学活性 2DOPA IGF 1和hUCMSCs在大鼠脊髓修复过程中发挥协同作用 DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs膜能明显地促进大鼠脊髓功能的恢复 IV关键词DOPA IGF 1 人脐带间充质干细胞 脊髓损伤 旁分泌 PLGA VAbstractA NovelApproach viaSurface Modificationof DegradablePolymers WithAdhesive DOPA IGF 1for NeuralTissue EngineeringAording to the nationalcenter forspinal cord injury statistics NSCISC The annualincidence ofSCI hasbeen reportedto be40cases permillion worldwideeach year mostly dueto trafficaidents followed byviolent injuries falls andsports injuries The microenvironmentat aspinal cord injury siteis plicated and morethan oneprocess needsto beregulated inorder forneurons andaxonal regrowthto our Not onlyshould hinderingfactors such asgliosis orinflammation be minimized but thecontrolled releaseof growthfactors shouldbe sustained In orderto solvethis problem neural tissueengineering hasattracted moreand moreattention inrecent years PLGA is a kindof themost promisingdegradable materialsin tissueengineering becausethe degradationrate of the copolymerand thephysical and chemical propertiescan beadjusted However PLGA haslittle advantagesin hydrophilicityand histopatibility Thus how to improve thebioactivity of PLGA isa difficultyto besolved With growthfactors andcells neural scaffoldsimplanted into the injuredspinal cordcan promotenerve regenerationand functionalrecovery In thepreliminary work we synthesizedDOPA IGF 1 When pHwas regulatedto8 5 the oxidationreaction ofcatechol groupsof DOPAwas consideredto resultedin chemicalcross linking it demonstratedthat thisDOPA IGF 1would leadtotheformation ofa proteinlayer onthe surfaceof titanium enhanced theNIH3T3adhesion and increasedthe cellgrowth activity IGF 1isa70amino acidspolypeptide IGF 1can promote the neuronsregeneration the growth of synapses cells proliferationand inhibitthe apoptosisof neurons IGF 1can alsopromote theproliferation migration secretion anddifferentiation ofmesenchymal stem cells Therefore DOPA IGF 1was modifiedon PLGA membrane surface toimprovethe biologicalactivity ofPLGA surfacefor providinga functionalbiological materialfor VIspinal cord injuryrepairation Object 1 DOPA IGF 1was modifiedon PLGAsurfacetoprepare DOPA IGF 1 PLGA membrane which waspared withcIGF 1to observe the biologicalactivity of hUCMSCs culturedon DOPA IGF 1 PLGA membrane 2 DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs membrane was preparedby conbininghUCMSCs and DOPA IGF 1 PLGA and itsrole was observed inhemisection spinal cordinjury of SD rats Method 1 SDS PAGE andwestern blotwere used to verify the targetprotein YKYKY IGF 1 Y IGF 1 For obtainingthe DOPA IGF 1 the tyrosinasehydroxylation turnsY intoDOPA The adsorptioncapacity ofcIGF 1 Y IGF 1 DOPA IGF 1on PLGA films was observed byELISA AFM XPS andContact AngleDetection were used to observethechanges of DOPA IGF 1 PLGA filmssurface physicalandchemicalproperties 2 The biological effect of hUCMSCs culturedon cIGF 1 PLGA Y IGF 1 PLGA andDOPA IGF 1 PLGA filmswas observed HUCMSCs proliferationwas observedby CCK 8and theoptimal concentrationof DOPA IGF 1was determined Cells adhesionand growthwere observedby phalloidinstaining qRT PCR andwestern blotassay wereusedtodetect thegenes expression and paracrine activity of hUCMSCs culturedon differentPLGA membranes 3 PC12cells wereinvestigated forthe functionalityof the paracrineactivityofhUCMSCs PC12cells werecultured inhUCMSCs culturemedium bycentrifugation The axon growth of PC12cells inacellular medium CM was detectedby opticalmicroscope the quantitativeanalysis ofaxongrowthof PC12cells wasdetedted byImageJ Gene expressionof PC12cells differentiationwas detectedby qRT PCR 4 DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs andPC12cells wereco cultured bytranswell methodtoobservethe synergistic effect between DOPA IGF 1and hUCMSCs The growthof PC12cells axonwas detectedby microscopeand VIIquantitativeanalysis wasmeasured byImageJ PC12cells differentiationwasobservedby immunofluorescenceMAP2staining 5 A hemisectionspinal cordinjuryofSDratswas establishedto furtherverifythe synergistic effect betweenDOPA IGF 1and hUCMSCson DOPA IGF 1 PLGA hUCMSCs films BBB scoreand EMGwereusedto evaluatemotor functionand neuroelectrophysiology respectively Histologically the recovery of injuredspinal cordwasobservedby HEstaining and immunofluorescence Result 1 In thisstudy the targetprotein Y IGF 1was obtainedthrough theamplification expression andpurification ofescherichia coli and theadhesive growthfactor DOPA IGF 1was obtainedthrough thehydroxylation oftyrosinase The PLGA membranewasincubated incIGF 1 Y IGF 据报道目前全球每年新增病例接近20万 1 平均年龄37 1岁 2 外伤或疾病均可导致脊髓损伤 完全性脊髓损伤指脊柱损伤部位以下运动感觉功能完全性丧失 不 完全性脊髓损伤则保留了部分功能 3 损伤处抑制性微环境 缺乏足够的神经营养支持 致密的瘢痕组织 神经元的凋亡和坏死及轴突损伤是中枢神经损伤后神经功能不能 有效恢复的主要原因 4 5 早期大剂量的甲强龙和神经营养药物广泛地应用在临床治疗中 6 7 然而 目前越来越多的研究表明大剂量甲强龙的治疗效果差强人意 并且对机体产生不可避免的损害 8 脊髓损伤对患者及其家庭都产生强大的精神和经济压力 故引起越 来越多社会和科研工作者的重视 组织工程学的出现使受损伤部位的修复和再生成为可能 生物材料 生长因子 细胞移植三者相结合的治疗方式提供了脊髓 损伤后神经再生和功能恢复极大的可能性 9 组织工程支架需要具备良好的生物相容性和生物活性方可植入受损 伤部位 该支架主要具备以下作用 1 将生长因子和种子细胞运送到受损部位 维持损伤部位良好的 微环境 2 提供有效的三维空间 保持细胞渗透性 维持液体和气体交换 促进细胞生长组织修复 为神经组织的生长提供支持作用 10 为了制备和脊髓功能相仿的支架材料 目前组织工程领域在材料选 择 生长因子与材料的结合方式 种子细胞的选择方面做了大量探 索 1 2基质材料的选择选择一种理想的脊髓修复材料一直是未能解决的 科学难题 理想中的支架应该更接近于组织的细胞外基质 为了设计合适的支架修复受损的组织 我们需要了解该材料的相关 特性 1 2 1支架的性能设计1 2 1 1生物相容性2生物相容性是一个至关重 要的特性 因为其直接影响细胞在材料上的黏附 生长 增殖和迁 移的能力 11 利用生物活性分子制备仿生材料可以对支架进行表面修饰 生物活 性分子如层黏连蛋白或者短肽链和支架材料表面结合 以模拟脊髓 的细胞外基质 extracellularmatrix ECM 12 改性后的材料表面更有利于细胞的黏附和增殖 细胞黏附性取决于材料的表面性质 如湿润性和电荷密度 13 生物相容性良好的基质材料能明显提高损伤修复效率 1 2 1 2生物降解性合成生物可降解支架的主要优点是无需手术摘除 可被机体吸收 在神经组织工程中 支架的作用是促进神经细胞的定向生长 并为 损伤局部提供力学支撑 组织的修复和材料的降解同步进行 防止预后取出材料造成机体的 二次创伤 故支架的降解性在材料选择方面非常重要 同时可降解支架也能促进临近的细胞产生自己的ECM 促进临近细胞 向损伤处的迁移 需要注意的是支架生物降解的副产物应该是无毒的并且容易被人体 有效排出 14 生物可降解性有助于消除组织慢性炎症 11 1 2 1 3机械强度支架应该具备与植入部位组织相同的力学性能 支架不仅要在降解前支持轴突的再生 还要承受脊柱和周围肌肉的 压力影响 10 聚合物纳米纤维在这方面具有很大的优势 他们在拉伸强度 拉伸 模量和压缩强度等方面对脊髓组织有一定的保护和支撑作用 同时良好的力学性能和多孔结构也能促进细胞的迁移和血管化 这 在一定程度上加快了神经的修复 15 水凝胶在神经组织工程中也具有广泛应用 其主要优势在于形状可塑性 良好的生物相容性和与脊髓相近的力 学性能 16 1 2 1 4支架形貌理想的支架形貌应该接近于天然组织的形状和孔隙 度 轴向的空隙 通道和排列整齐的纤维有助于诱导神经定向分化生长 17 类似于自然基质的连续多孔结构为轴突再生提供良好的环境 研究表明 孔隙率在90 且100 m 500 m的空隙大小有利于细胞的附着和代谢 为神经修复提供有效 的组织桥梁 18 空隙之3间相互连接以促进细胞营养物质的交换和组织液的扩散 但空隙并不是越大越好 过大的孔隙度也会影响细胞和材料之间的 结合及组织有效长入 19 1 2 2支架的材料学分类1 2 2 1天然聚合物材料天然聚合物材料因 其良好的生物相容性和天然降解性在神经组织工程中应用广泛 天然聚合物材料有不同的 如ECM成分的胶原蛋白 海洋物质中提取 的海藻酸盐 甲壳类动物的壳聚糖物质和昆虫吐出的蚕丝蛋白等 它们是天然ECM的有效成分 因此在神经组织修复中具有被组织细胞 识别的特性 促进其在宿主体内的整合 20 1 2 2 1 1胶原人体有28种胶原蛋白 最常见的为I型胶原蛋白 是 一种纤维性胶原蛋白 它是结缔组织的主要成分 广泛存在于肌肉 骨骼 神经 皮肤当 中 21 通过胶原蛋白制成的神经纺丝移植到损伤的神经间隙 类似于神经 移植 22 在一项研究中 胶原导管连接在完全横断的脊髓损伤区域 结果显 示轴突在管腔内生长并且抑制了胶质瘢痕的生长 23 胶原蛋白也可以和其他的生物分子结合使用 有研究应用胶原和层粘连蛋白联合使用促进了大鼠脊髓轴突的生长 和运动功能的恢复 24 胶原蛋白作为神经组织工程材料已经被广泛研究 因此医疗市场上 已经出现由胶原蛋白制作的神经导管 Neuromaix公司生产的神经导管首次应用即产生良好的生物学效果 2 5 可见胶原导管是目前临床上较有前景的生物材料 1 2 2 1 2明胶明胶是动物胶原蛋白经酸或者碱水解而得的变性蛋白 明胶在药品和食品领域广泛应用 其主要的优势在于低成本 高实 用性 良好的生物降解性和生物相容性 同时 作为变性蛋白 明胶的抗原性低于胶原蛋白 故其能促进细 胞的黏附和增殖 改善植入后组织的生物学行为 26 明胶静电纺丝在神经组织工程中的优势在于其良好的机械和生物力 学性能 3D电纺纳米纤维明胶导管可以促细胞分化为运动神经元 显示出