绿豆幼苗UV-B敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系

中国农业科学 2006 39 7 1358 1364 Scientia Agriucultura Sinica 收稿日期 2005 06 24 接受日期 2006 02 17 基金项目 国家自然科学基金项目 30470324 和陕西省自然科学研究计划项目 2003C101 作者简介 贺军民 1965 男 陕西洛南人 副教授 博士 研究方向为植物生理生化 Tel 029 85308451Fax 029 85303736 E mail hejm1965 绿豆幼苗 UV B 敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系 贺军民 王瑞斌 孟朝妮 陕西师范大学生命科学学院 西安 710062 摘要 目的 明确绿豆品种间 UV B 敏感性的差异与环丁烷嘧啶二聚体 CPDs 累积间的关系 方法 采 用单克隆抗体 ELISA 法 研究 0 4 W m 2UV B 对两绿豆品种中绿 1 和秦豆 20 Phaseolus raditus L cv Zhongl 1 and Qindou 20 幼苗叶片 DNA 链内环丁烷嘧啶二聚体 CPDs 的诱导形成及其光 暗修复 并对 CPDs 累积与绿豆 UV B 敏感性的关系进行分析 结果 两品种绿豆幼苗经 UV B 处理 4 d 后 中绿 1 叶片的生物量和 净光合速率被抑制的程度明显低于秦豆 20 说明中绿 1 对 UV B 的敏感性低于秦豆 20 相应中绿 1 叶片 DNA 中 CPDs 累积量和其形成能力也都低于秦豆 20 光修复能力明显高于秦豆 20 而两品种 CPDs 的暗修复能力基本相 同 且均显著低于光修复能力 结论 两品种幼苗 CPDs 形成能力和光修复能力的不同造成了两品种幼苗叶片在 可见光下 CPDs 累积量的不同 进而可能导致了绿豆品种间 UV B 敏感性的不同 另外 两品种 CPDs 形成能力的差 异与紫外吸收物质含量有关 关键词 绿豆 环丁烷嘧啶二聚体 CPDs UV B 敏感性 DNA 修复 Cyclobutyl Pyrimidine Dimer Accumulation in Ralation to UV B Sensitivity in Mung Bean Cultivars HE Jun min WANG Rui bin MENG Zhao ni College of Life Sciences Shaanxi Normal University Xi an 710062 Abstract Objective The purpose of the experiment is to reveal the relationship between cyclobutyl pyrimidine dimers CPDs accumulation and UV B sensitivity in mung bean cultivars Method Two mung bean cultivars Phaseolus raditus L cv Qindou 20 and Zhongl 1 were grown in greenhouse with treatment or without treatment of UV B radiation 0 4 W m 2 for four days The UV B induced CPDs in mung bean DNA were quantified by enzyme linked immunosorbent assay ELISA with specific monoclonal antibody and the relationship between CPDs accumulation and the UV B sensitivity of mung bean seedlings were discussed Result The UV B induced inhibition of the biomass and net photosynthetic rate of the primary leaves of cultivar Zhongl 1 were respectively lower than that of cultivar Qindou 20 so that the cultivar Zhongl 1 was more tolerant to UV B than the cultivar Qindou 20 Meanwhile the cultivar Zhongl 1 had lower CPD accumulation and susceptibility to CPD induction higher photorepair capacity and same dark repair capacity as compared with the cultivar Qindou 20 Conclusion Different UV B sensitivities between two mung bean cultivars may be mainly caused by the differences in CPD accumulation which are caused by the different susceptibility to CPD induction and the different photorepair capacities In addition the different susceptibility to CPD induction between two mung bean cultivars is related to the different levels of UV absorbing compounds Key words Mung bean Phaseolus raditus L Cyclobutyl pyrimidine dimers CPDs UV B sensitivity DNA repair 0 引言 本研究的重要意义 臭氧层减薄导致更多的 UV B 辐射到达地表 这种增强的 UV B 辐射对植物生 长发育 生理代谢及生态等方面的效应已被大量研究 但关于其分子机制却知之较少 1 2 通过对 UV B 敏感 性不同的植物品种进行研究 揭示其品种间 UV B 敏 感性差异与 DNA 损伤程度及其修复能力间的关系 7 期 贺军民等 绿豆幼苗 UV B 敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系 1359 这不仅对阐明植物抗 UV B 辐射的分子机制具有重要 的理论意义 而且对人们筛选和培育抗 UV B 辐射的 植物品种具有重要的指导价值 前人研究进展 UV B辐射下DNA损伤及修复的研究在微生物和哺乳 动物细胞方面已有大量工作 且较深入 但在高等植 物方面目前仅在少数植物如拟南芥 水稻 黄瓜等上 进行了一定研究 3 6 从现有的结果可见 UV B 辐射 对高等植物 DNA 的损伤主要是使同一条链上相邻的 两个嘧啶碱基以共价键结合形成嘧啶二聚体 环丁烷 嘧啶二聚体 CPDs 和 6 4 光产物 6 4PPs 3 7 8 其中 CPDs 占 75 9 植物为了降低 UV B 辐射导致的 DNA 损伤常采取两种策略 一是在叶表皮细胞或 和 叶肉细胞内累积类黄酮物质来吸收 UV B 10 12 二是 通过光修复和暗修复机制来消除已形成的嘧啶二聚 体 3 7 8 13 另外 通过对不同品种的水稻及拟南芥突 变体等植物的研究 人们也发现 CPDs 修复能力的强 弱或类黄酮物质含量的高低与植物 UV B 敏感性间具 有明显的相关性 4 6 14 16 然而 这种相关性是否具有 普遍性还有待进一步在其它植物中得到证实 本研 究的切入点 绿豆是重要的农作物 其品种繁多且具 有重要的药用价值 笔者以前的工作已表明 增强的 UV B 辐射对绿豆的生长和生理具有显著影响 17 18 但 UV B 辐射下绿豆 DNA 中 CPDs 形成及其修复如何 以及该DNA损伤与绿豆UV B敏感性间有何关系均未 见报道 拟解决的关键问题 笔者以两绿豆品种秦 豆 20 和中绿 1 号的幼苗为材料 研究 UV B 下两品种 幼苗叶片DNA链内CPDs的诱导形成及其光 暗修复 以期揭示绿豆品种间 UV B 敏感性的差异与 CPDs 累 积及其修复能力间的关系 1 材料与方法 1 1 材料及处理 试验于 2003 2004 年在陕西师范大学生命科学 学院植物材料培养室进行 绿豆品种中绿 1 和秦豆 20 Phaseolus raditus L cv Zhongl 1 and Qindou 20 种 子购置于陕西省西安市种子公司 种子经 5 次氯酸 钠消毒后 25 C 温箱内预萌发 20 h 选择萌发一致的 种子均匀种于盛有干净沙子的 12 只瓷盘中 每品种 6 盘 每盘种 50 粒种子 材料培养于植物材料培养室内 每日早晚用蒸馏水喷洒 培养条件为 光照强度 300 350 mol m 2 s 1 每日光照 12 h 8 00 20 00 昼 夜 温度 30 20 C 相对湿度 70 上述条件下培养 5 d 后 所有材料每日改用 1 2 Hoagland 溶液浇灌 19 直至试验结束 每次浇灌时用 新鲜溶液 2 次将沙盘浇灌至饱和状态 然后倾去多余 溶液 4 d 后 两品种各 3 盘材料增加 UV B 辐射处理 试验共 4 个处理 3 个平行 3 次重复 辐射处理用 20 W Q Panel UV313 紫外灯管 Largo Goteborg Sweden 最大发射峰在 313 nm 灯管产生的 UV B 辐射经 0 08 mm 乙酸纤维素膜过滤后照射植物 照射 时间同可见光 在整个实验过程中 通过调节紫外灯 管与植株顶层的高度使植株顶层 UV B 辐射强度始终 维持在 0 4 W m 2 紫外辐射剂量用 UV B 辐照计 北 京师范大学光电仪器厂生产 测定 为了测定 CPDs 的累积量 UV B 辐射期间每日 14 00 时取幼苗第一对真叶 置于液氮中备用 生物量 的测定是在 UV B 辐射处理 4 d 后 剪取各处理 50 株 幼苗的第一对真叶 于 80 C 烘至恒重后称量 CPDs 形成能力及光 暗修复能力测量时 将可见光下生长 11 d 的幼苗置于 30 C 黑暗下增加 0 4 W m 2 的 UV B 辐射 1 h 之后立即取样用于 CPDs 形成能力的测量或 转移到黑暗或蓝光下 30 C 再培养不同时间后取样 分别用于暗修复或光修复能力的测量 蓝光处理用日 本东芝电器公司生产的 20W 蓝色荧光灯 灯生产的光 经德国生产的 PG 627 3 型蓝色滤光膜 R hm Darmstadt Germany 过滤后照射植物 过滤后的光为 纯蓝光 其发射最强波长在 450 nm 半高宽为 43nm 1 2 光合强度的测量 UV B 辐射处理第 4 天的 13 00 15 00 时用便携 式 CIRAS 2 型光合测定仪 PP SYSTEM 公司制造 直接测定幼苗第一对真叶 测定光强为 900 1 000 mol m 2 s 1 1 3 紫外吸收物质含量的测定 材料于可见光下培养 11 d 时取幼苗第一对真叶 参照 Hideman 等 16 的方法测定 以每克鲜重叶的光吸 收值表示紫外吸收物质的含量 A305nm g 1 FW 1 4 DNA 的提取 DNA 提取用植物微量 DNA 提取试剂盒 DNeasy Plant Mini Kit 德国 QiagenGmbH 产品 操作流程按 试剂盒的说明进行 为了避免光修复的干扰 一切操 作均于暗淡的红光下进行 DNA 浓度用紫外分光光度 法在核酸分析仪 Ultrospec 2000 型 上测定 DNA 样品于 20 C 下保存备用于 CPDs 的测定 1 5 CPDs 的 ELISA 测定 单克隆抗体 KTM 53 购于美国 Kamiya 生物医学 公司 它被证明能专一识别单链和双链 DNA 上的环 1360 中 国 农 业 科 学 39 卷 丁烷嘧啶二聚体 CPDs 20 96 孔聚氯乙烯微量酶 标板的预处理按 Armstrong 等 21 的方法用 0 04 鱼精 蛋白硫酸盐 Sigma 处理 2 h CPDs 的酶联免疫法 ELISA 测定参考 Mori 等 22 方法 实验步骤按李韶 山 15 的方法进行并略加修改 具体步骤如下 上述提取的 DNA 样品于沸水浴中 10 min 使其变 性 然后冰浴中快速冷却 取浓度为 1 g ml 1的变性 DNA溶液50 l于预处理过的96孔聚氯乙烯微量酶标 板内 置于 90 C 保温 1 h 使其干燥 干燥后用 PBS T 溶液 含 0 05 Tween 20 的 PBS 缓冲液 0 01 mol L 1 pH 7 4 冲洗酶标板 5 次 冲洗完后每孔加含 3 牛 血清白蛋白 BSA Sigma 的 PBS 缓冲液 200 l 置于 37 C 放置 30 min 再次用 PBS T 缓冲液冲洗 5 次 之后每孔加稀释的单克隆抗体溶液 100 l 单抗 溶液 PBS T 1 2 000 置于 37 C 保温 1 h 其后用 PBS T 缓冲液冲洗 5 次后 每孔加稀释过的二抗 IgG 溶液 100 l IgG 为带有过氧化物酶的山羊抗鼠多克 隆抗体 用 PBS T 溶液稀释 稀释比例为 1 1 000 购 于 Sigma 置于 37 C 保温 0 5 h 之后先用 PBS T 缓 冲液冲洗 3 次 再用 pH 5 0 柠檬酸缓冲液冲洗 2 次 上述操作完成后每孔加反应底物 pH 5 0 柠檬酸缓冲 液内含 0 04 邻苯二胺 0 007 H2O2 100 l 37 C 下反应 0 5 h 之后每孔加 50 l 2 mol L 1 H2SO4终止 反应 用酶标仪测定 490 nm 处的光吸收值 1 6 数据分析 数据分析用 SPSS 软件进行 图中数据为 9 次测 量的平均值 标准误差 2 结果与分析 2 1 两品种绿豆幼苗的 UV B 敏感性 如图1所示 两品种绿豆幼苗经0 4 W m 2的UV B 辐射处理 4 d 后第一对真叶的生物量和净光合速率均 明显受到抑制 但两品种被抑制的程度明显不同 4 天的 UV B 辐射处理使秦豆 20 第一对真叶的生物量 和净光合速率分别被抑制 7 7 和 40 2 而中绿 1 分 别被抑制 3 3 和 31 5 可见 两品种绿豆幼苗的 UV B 敏感性明显不同 中绿 1 对 UV B 辐射的抗性 较强 而秦豆 20 的抗性较弱 2 2 UV B 辐射下绿豆幼苗叶片 CPDs 的累积 由图 2 可见 可见光下增加 UV B 辐射后两品种 绿豆幼苗叶片 DNA 链内环丁烷嘧啶二聚体 CPDs 均显著积累 但两品种 CPDs 的累积程度及趋势明显 不同 在整个 UV B 辐射期间 敏感品种秦豆 20 的 抑制率 CK UV B CK 100 Inhibition percentage CK UV B CK 100 图1 UV B辐射对绿豆幼苗第一对真叶生物量 A 和净光合 速率 B 的影响 Fig 1 Effects of UV B radiation on biomass A and net photosynthetic rate B of the primary leaves of mung bean seedlings 图 2 UV B 辐射下绿豆幼苗叶片内 CPDs 累积的时间过程 Fig 2 Time course of the UV B induced CPDs accumulation in the primary leaves of mung bean seedlings 7 期 贺军民等 绿豆幼苗 UV B 敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系 1361 CPDs 积累量始终高于抗性品种中绿 1 随 UV B 辐射 时间的延长 敏感品种秦豆 20 的 CPDs 累积量越来越 高 而抗性品种中绿 1 的 CPDs 累积量增加程度很小 2 3 黑暗下 UV B 对绿豆幼苗叶片 CPDs 的诱导形成 前人的研究已表明 CPDs 的修复以光修复为主 且速度较快 而暗修复的量很小 且速度极为缓 慢 3 6 15 在测定 UV B 辐射下两品种绿豆幼苗 CPDs 的形成能力时 为了避免光修复和暗修复的干扰 将 可见光下生长 11 d 的两品种幼苗置于黑暗下 用 0 4 W m 2的 UV B 辐射处理 1 h 之后立即取样并测定 DNA 的 CPDs 形成量 由图 3 可见 在 1 h 的 UV B 辐射诱导下 敏感品种秦豆 20 的 CPDs 形成量明显高 于抗性品种中绿 1 说明在可见光下增加相同剂量的 UV B 辐射后两品种绿豆幼苗叶片内 CPDs 累积量的 不同与两品种 CPDs 的形成能力有关 图 3 黑暗下 UV B 辐射对绿豆幼苗 CPDs 形成的诱导 Fig 3 Induction of CPDs by UV B radiation under darkness in mung bean seedlings 2 4 两品种紫外吸收物质含量的差异 在植物叶表皮及其下层叶肉细胞常含有类黄酮等 紫外吸收物质 其最大吸收峰在紫外区 对照射在叶 表面的紫外线穿过叶表皮到达光合组织起了一定的过 滤作用 12 23 24 那么 若两品种紫外吸收物质含量不 同 即使处在相同剂量的 UV B 辐射下 到达叶肉组 织的实际 UV B 辐射剂量也会不同 这是否是两品种 幼苗叶片处在相同剂量 UV B 辐射下而 CPDs 形成量 不同的原因 为了说明这一问题 对两品种幼苗叶片 的紫外吸收物质含量进行了测定 图 4 结果显示 抗性品种中绿 1 叶片的紫外吸收物质含量明显高于敏 感品种秦豆 20 可见两品种幼苗叶片紫外吸收物质含 量与 CPDs 的形成量之间具有明显的负相关性 图 4 两品种绿豆幼苗第一对真叶紫外吸收物质的含量 Fig 4 The amounts of UV absorbing compounds in the primary leaves of two mung bean cultivars 2 5 CPDs 的暗修复 由图 5 可见 当黑暗下经 1 h UV B 辐射的两品种 绿豆幼苗继续于黑暗下培养时 UV B 辐射诱导的 CPDs 随培养时间的延长缓慢减少 且两品种减少的 程度相同 与 UV B 辐射 1 h 时的 CPDs 水平相比 黑 暗下培养 24 h 时 两品种的 CPDs 含量均减少了 14 上述结果表明 两绿豆品种均存在 CPDs 的暗修复 且两品种的暗修复能力基本相同 图 5 绿豆幼苗叶片内 CPDs 暗修复的时间过程 Fig 5 Time course of CPDs dark repair in the primary leaves of mung bean seedlings 1362 中 国 农 业 科 学 39 卷 2 6 CPDs 的光修复 由图 6 可见 当黑暗下经 1 h UV B 辐射的两品种 幼苗转移到蓝光下培养时 UV B 辐射诱导的 CPDs 在蓝光培养的 0 5 h 内均快速下降 之后 随培养时间 的延长下降速度均逐渐变慢 但蓝光下两品种 CPDs 下降的程度有所不同 抗性品种中绿 1CPDs 的下降程 度始终大于敏感品种秦豆 20 与图 5 暗修复能力相 比 两品种 CPDs 的光修复速度及程度均分别显著大 于各自的暗修复 可见 两品种绿豆幼苗叶片内 CPDs 的修复均以光修复为主 且抗性品种中绿 1 的光修复 能力明显大于敏感品种秦豆 20 图 6 绿豆幼苗叶片内 CPDs 光修复的时间过程 Fig 6 Time course of CPDs photorepair in the primary leaves of mung bean seedlings 3 讨论 前人的工作已表明一些植物的不同品种在 UV B 敏感性上往往存在一定的差异 6 15 绿豆也不例外 从本文的结果可见 相同剂量的 UV B 辐射对绿豆品 种中绿 1 的生物量和净光合速率 图 1 的抑制程度 均明显小于对绿豆品种秦豆 20 的影响 说明中绿 1 对 UV B 辐射的抗性较强 而秦豆 20 对 UV B 辐射较 为敏感 这与两品种绿豆幼苗在相同剂量 UV B 辐射 下 Rubisco 含量及 H2O2水平的变化相一致 17 近年来 对几种植物的研究已显示 植物间 UV B 敏感性的不同与 UV B 辐射下嘧啶二聚体的累积量或 其修复能力的高低有明显的相关性 如 Britt 等 4 表明 紫外辐射敏感型拟南芥突变体具有正常的 CPDs 修复 能力 但缺少 6 4PPs 修复能力 Landry 等 14 的研究 显示 缺少 CPDs 修复能力的拟南芥突变体对 UV B 高度敏感 Hidema 6 和李韶山 15 等也分别证实 紫外 辐射耐受型水稻品种的 CPDs 光修复效率比敏感品种 高 因而 UV B 辐射下耐受型水稻品种的 CPDs 累积 量也比敏感品种低 本结果首次在两个绿豆品种上证 明了上述植物 UV B 敏感性与嘧啶二聚体累积量之间 的关系 由图 2 可见 相同剂量的 UV B 辐射期间抗 性品种中绿 1 CPDs 的累积量始终明显低于敏感品种 秦豆 20 由于 CPDs 的形成能抑制 DNA 的复制 这 势必导致植物的生理伤害和生长受阻 3 7 8 由此笔者 认为绿豆品种间 UV B 敏感性的差异可能是由于不同 品种在UV B辐射下DNA中CPDs累积程度不同所导 致的 为了探讨两品种绿豆幼苗在可见光下增加相同剂 量 UV B 后 CPDs 累积量不同的原因 进一步对 CPDs 的形成能力 图 3 光修复 图 6 和暗修复 图 5 能力进行了测定 结果显示抗性品种中绿 1 比敏感品 种秦豆 20 具有较低的 CPDs 形成能力 较高的 CPDs 光修复能力和相同的暗修复能力 说明两品种幼苗在 可见光下增加相同剂量的 UV B 射后 CPDs 累积量的 不同主要是由于 CPDs 的形成能力和光修复能力的不 同所导致的 同时 结果也说明两品种绿豆幼苗修复 CPDs 均存在光修复和暗修复两种机制 但均以光修 复为主 这一状况与拟南芥 水稻等植物相同 4 6 15 但不同于黄瓜子叶 黄瓜子叶无暗修复 CPDs 的能 力 5 最近 Hidema 等 25 研究表明水稻品种 Sasanishiki和Surjamkhi间UV B敏感性的差异是由于 负责 CPDs 光修复的光修复酶基因的 377 和 888 位核 苷酸在 UV B 敏感型品种 Surjamkhi 内发生了突变 从 而可能导致该品种光修复酶多肽链的第 126 和 296 位 氨基酸改变 进而使其 CPDs 光修复酶活性显著低于 UV B 耐受性品种 Sasanishiki 该结果进一步显示了植 物品种间 UV B 敏感性的差异与 CPDs 光修复酶基因 间的关系 这为人们通过常规育种或分子生物学手段 来提高植物抗 UV B 能力奠定了基础 那么绿豆品种 间 CPDs 光修复能力间的差异是否也与它们的光修复 酶基因不同有关 这是一个非常值得深入研究的问题 植物在防御 UV B 辐射导致的 DNA 伤害上 除通 过光修复和暗修复机制来消除已形成的 CPDs 外 还 可在叶表皮细胞或 和 叶肉细胞内累积类黄酮物质 来吸收 UV B 如 Stapleton 和 Walbot 10 的试验显示类 黄酮含量低的玉米等基因系对UV B辐射诱导的DNA 伤害敏感 Hidema 和 Kumagai 11 也报道 UV B 辐射能 诱导紫外吸收物质含量低的水稻叶片产生较高水平的 7 期 贺军民等 绿豆幼苗 UV B 敏感性与环丁烷嘧啶二聚体累积的关系 1363 CPDs Schmitz Hoerner 和 Weissenb ck 12 也证实缺乏 类黄酮的大麦突变体在UV B辐射下表现严重的DNA 损伤 这种紫外吸收物质含量与 UV B 辐射诱导的 DNA 伤害间的相关性也被本研究在绿豆幼苗上得到 证实 从图 3 和图 4 可见 抗性品种中绿 1 叶片内紫 外吸收物质含量高于敏感品种秦豆 20 相应抗性品种 的 CPDs 形成量也明显低于敏感品种 紫外吸收物质 现已被认为是一类保护叶片表皮下组织免受 UV B 伤 害的天然屏障 12 23 24 因此笔者认为两品种绿豆幼苗 间 CPDs 形成量的差异主要是由紫外吸收物质含量的 不同所导致的 此外 两品种绿豆幼苗在叶片大小 叶片厚度以及其它生化和结构上的差异也可能会影响 叶片对 UV B 辐射的透过 进而影响 CPDs 的形成 由于环境的恶化 到达地表的 UV B 辐射还在不 断增强 因而选育抗 UV B 辐射品种势在必行 本文 结果初步揭示了绿豆幼苗抵抗 UV B 辐射的能力与其 CPDs 的光修复能力和叶片紫外吸收物质含量有关 这为人们初步筛选抗 UV B 辐射的绿豆品种提供了一 定的理论基础 今后 在此基础上进一步研究绿豆品 种间上述差异与它们基因间的关系也大有必要 4 结论 0 4 W m 2的 UV B 辐射能诱导两绿豆品种中绿 1 和秦豆 20 幼苗叶片 DNA 链内产生交联形成 CPDs 两绿豆品种修复 CPDs 的方式均有光修复和暗修复两 种机制 但均以光修复为主要方式 可见光下两绿豆 品种间 CPDs 累积量的不同与品种间 CPDs 的形成能 力和光修复能力的不同有关 两绿豆品种间 CPDs 形 成能力的差异是由叶片内紫外吸收物质含量的不同所 导致的 两绿豆品种间 UV B 敏感性的差异与 UV B 辐射下叶片 DNA 中 CPDs 累积程度不同有关 References 1 Caldwell M M Termurea A H Tevini M Bornman J F Bj rn L O Kulandaivelu G Effects of increased solar ultraviolet radiation on 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