CN106552294A一种用于心脏修复的生物补片材料

CN106552294ACN106552294A一种用于心脏修复的生物补片材料一种用于心脏修复的生物补片材料 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请号xx10622880 0 22 申请日xx 09 25A61L27 56 xx 01 A61L27 38 xx 01 A61L27 50 xx 01 A61L27 22 xx 01 71 申请人上海市东方医院地址xx20上海市浦东新区即墨路150号 72 发明人唐文洁屠一栋刘中民 74 专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司31266代理人陆凤 刘妍珺 54 发明名称一种用于心脏修复的生物补片材料 57 摘要本发明涉及一种生物补片材料 具体地 涉及一种用于促 进心脏功能修复的生物补片材料 所述生物补片材料包括 i 至少二个复合在一起的多孔结构层 所述 的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结构层 其中所述的修复细 胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎 干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 和 ii 负载于所述第二结构层的所述的修复细胞 并且至少一部 分或全部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中 发明的生物补片材料可负载修复细胞的生长 并具有非常良好的生 物相容性和机械强度 51 Int Cl 19 中华人民共和国国家知识产权局 12 发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图3页106552294Axx 0 4 05106552294A1 2页21 一种用于心脏修复的生物补片材料 其特 征在于 所述补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹配 并且所述补片材料包括 i 至少二个复合在一起的多孔结构层 所述 的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结构层 其中所述的修复细 胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 ii 负载 于所述第二结构层的所述的修复细胞 并且至少一部分或全部所述 的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中 2 如权利要求1所述的生物补片材料 其特征在于 所述第一结构层 还可防止炎症细胞渗透 3 如权利要求1所述的生物补片材料 其特征在于 所述第一结构层 具有第一孔隙度A1 所述第二结构层具有第二孔隙度A2 并且A2大 于A1 4 如权利要求1所述的生物补片材料 其特征在于 所述修复细胞的 负载量为1 102 1 105个 mm3 较佳地 5 102 5 104个 mm3 更佳地 1 103 1 104个 mm3 按所述第二结构层的体积计 5 如权利要求1所述的生物补片材料 其特征在于 所述的多孔结构 层含有交联在一起的以下组分 a 弹性蛋白原 弹性蛋白 或其片段 和 b 粘多糖 6 如权利要求5所述的生物补片材料 其特征在于 在所述的多孔结 构层中 所述弹性蛋白为交联型弹性蛋白 即通过交联剂进行交联 反应而形成的交联产物 7 一种用于心脏修复的试剂盒 其特征在于 所述的试剂盒包括一 容器 以及位于所述容器中的如权利要求1所述的生物补片材料 8 如权利要求1所述生物补片材料的制备方法 其特征在于 包括步 骤 a 提供一多孔结构件 所述的多孔结构件包括至少二个复合在一 起的多孔结构层 所述的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的 第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结 构层 和 b 将所述的修复细胞接种于所述第二结构层 形成接种有 修复细胞的多孔结构件 其中所述的修复细胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 c 任选地 对上一步骤中所述接 种有修复细胞的多孔结构件进行培养处理 使得接种的修复细胞进 行增殖和传代 从而获得经培养处理的多孔结构件 其中 所述接 种有修复细胞的多孔结构件或经培养处理的多孔结构件即为权利要 求1所述生物补片材料 9 如权利要求8所述的制备方法 其特征在于 所述方法还包括在步 骤 a 之前的制备所述多孔结构件的步骤 a1 提供一混合物 所述混 合物含有弹性蛋白 赖氨酸交联剂 粘多糖和惰性溶剂 如磷酸盐缓 冲液 a2 对上一步骤所述的混合物进行压模成型 形成具有所述 第一多孔结构层和第二多孔结构层的多孔结构件 权利要求书106552294A22 2页310 如权利要求1所述生物补片材料的 用途 其特征在于 用于制备治疗心脏疾病的医用补片 权利要求书106552294A31 8页4一种用于心脏修复的生物补片材料技 术领域 0001 本发明涉及生物医学材料 具体地 涉及一种用于心 脏修复的生物补片材料 背景技术 0002 随着经济水平的不断提高和社会老龄化程度的加深 心血管疾病的发病率不断攀升 心力衰竭是各种心血管疾病发展到终末期的临床综合症状 也是心 血管疾病导致死亡的主要原因 号称心血管领域的 头号杀手 目前 全世界心力衰竭患者约有1 17亿人 其中美洲约1462 1万人 欧洲约1558 6万人 亚洲约8636 4万人 我国约有2997 1万心力衰竭患者 占全世界总数的25 6 由此而产生的医疗费用逐年增加 社会和家庭负担严重 0003 虽然传统的药物治疗 介入治疗或外科搭桥手术和心衰晚期 使用的器械辅助装置等可以重建血运 减少进一步的疤痕形成和不 利的心室重构 并增加未受损心肌的功能 但不能挽救已经死亡的 心肌细胞 无法使 死的 疤痕组织转变为有功能的相关细胞 无 法逆转伴随而来的心力衰竭 心脏移植是治疗终末期心力衰竭的有效手段 但由于供体的严重短 缺无法在临床上广泛应用 而干细胞移植疗法由于可促进梗死局部 心肌和血管再生 成为目前最有前景的治疗手段之一 0004 目前 干细胞治疗心肌梗死后 缺血性 心力衰竭的临床试验 多采用经导管心肌内注射细胞的方法 这种方法的局限性在于细胞 在心肌内的滞留率极低 除细胞注射方法之外 开发促进心脏功能修复的相关生物材料已经 成为近年来业界的研究热点 0005 然而 目前的促进心脏功能修复的相关生物材料又有诸多问 题 如生物相容性差 不能随意制成病理部位相应形态 对细胞组 织有毒害 不利于细胞的生长与分化 有免疫原性 不能阻滞炎症 细胞的入侵及分解 机械强度不高等等 0006 因此 本领域迫切需要开发一种生物相容性好 对细胞组织 无毒 机械强度高的生物补片材料 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种生物相容性好 对细胞组 织无毒 机械强度高的生物补片材料 0008 本发明的第一方面提供了一种用于心脏修复的生物补片材料 所述补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹配 并且所 述补片材料包括 0009 i 至少二个复合在一起的多孔结构层 所述 的多孔结构层包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结构层 其中所述的修复细 胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎 干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 0010 i i 负载于所述第二结构层的所述的修复细胞 并且至少一部分或全 部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中 说明书106552294A42 8页5 0011 在另一优选例中 所述第一结构层 还可防止炎症细胞渗透 0012 在另一优选例中 所述第一结构层具有第一孔隙度A1 所述 第二结构层具有第二孔隙度A2 并且A2大于A1 0013 在另一优选例中 所述的第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A 2 A1 5 较佳地 8 更佳地 10 0014 在另一优选例中 所述的第一孔隙度A1为1 10 m 较佳地为2 6 m 0015 在另一优选例中 所述的第二孔隙度A2为20 200 m 更佳地为25 100 m 0016 在另一优选例中 所述的第一结构层的厚度为0 01 0 05cm cm 较佳地为0 01 0 02cm 0017 在另一优选例中 所述的第二结构层的厚度为0 05 0 5cm 较佳地 0 1 0 25cm 0018 在另一优选例中 所述的生物补片材料的主表面的面积为10 80cm2 较佳地为25 55cm2 0019 在另一优选例中 所述第二结构层面向需修复的心脏部位 或 组织 0020 在另一优选例中 所述的第二结构层朝向心脏表面 而所述 的第一结构层在第二结构层外侧 0021 在另一优选例中 所述需修复的心脏部位至少包括心脏缺血 区 0022 在另一优选例中 所述修复细胞的负载量为1 102 1 105个 mm3 较佳地 5 102 5 104个 mm3 更佳地 1 103 1 104个 mm3 按所述第二结构层的体积计 0023 在另一优选例中 所述修复细胞人或非人哺乳动物 0024 在另一优选例中 所述的第一结构层和第二结构层的材质是 相同的或不同的 优选相同的 0025 在另一优选例中 所述生物补片材料的材质为生物可降解且 生物相容的材料 0026 在另一优选例中 所述的第一结构层为弹性蛋白基的 elasti n based 0027 在另一优选例中 所述的第二结构层为弹性蛋白基的 0028 在另一优选例中 所述多孔结构层均为弹性蛋白基的结构层 0029 在另一优选例中 所述的生物补片材料还可含有其他结构层 0030 在另一优选例中 所述的生物补片材料还包括位于所述第一 结构层和所述第二结构层之间的中间结构层 0031 在另一优选例中 所述的多孔结构层由所述的第一结构层和 所述的第二结构层构成 0032 在另一优选例中 所述的多孔结构层含有交联在一起的以下 组分 0033 a 弹性蛋白原 弹性蛋白 或其片段 和 0034 b 粘 多糖 0035 在另一优选例中 所述的多孔结构层由交联在一起的上述组 分 a 和组分 b 构成 0036 在另一优选例中 在所述多孔结构层中 所述弹性蛋白为交 联型弹性蛋白 即通过交联剂进行交联反应而形成的交联产物 0037 在另一优选例中 所述弹性蛋白为动物体中提取的弹性蛋白 及弹性蛋白片段 选自下组弹性蛋白原 Tropoelastin 弹性蛋白 elastin 或其组合 说明书106552294A53 8页6 0038 在另一优选例中 所述粘多糖选自 下组肝素 硫酸软骨素 硫酸乙酰肝素或其组合 0039 在另一优选例中 所述的交联剂为赖氨酸交联剂 0040 在另一优选例中 所述的赖氨酸交联剂选自下组Bis sulfosu inimidyl suberate sodiumsalt BS3 戊二醛 4 4 二异氰酸酯二环己基甲烷 HMDI 或其组合 0041 在另一优选例中 所述的第一多孔结构层和 或第二多孔结构 层中 按相应结构层的体积计 各组分的含量如下 0042 弹性蛋白 的含量为5 200mg cm3 较佳地 1 150mg cm3 更佳地 50 100mg cm3 0043 粘多糖的含量为0 1 100mg cm3 较佳地 1 50mg cm3 更佳地 10mg cm3 0044 在另一优选例中 所述的生物补片材料具有以下一种或多种 特性 0045 i 支持所述修复细胞的生长和分化为心脏细胞 包括心 肌细胞 血管平滑肌细胞 血管内皮细胞 心脏成纤维细胞等 0 046 i i 机械性能 拉伸率 1 1 0047 在另一优选例中 所述的拉伸率指将所述生物补片材料拉伸 至发生无法恢复时 或发生破裂时 的拉伸长度与原长度之比 0048 在另一优选例中 所述的生物补片材料是用本发明第三方面 所述的方法制备的 0049 本发明第二方面提供了一种用于心脏修复的试剂盒 所述的 试剂盒包括 0050 一容器 0051 以及位于所述容器中的如本发明 第一方面所述的生物补片材料 0052 本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的生物补片材 料的制备方法 包括步骤 0053 a 提供一多孔结构件 所述的多孔 结构件包括至少二个复合在一起的多孔结构层 所述的多孔结构层 包括用于防止修复细胞流失的第一结构层和用于负载 或容纳 用于 修复心脏的修复细胞的第二结构层 和 0054 b 将所述的修复细胞 接种于所述第二结构层 形成接种有修复细胞的多孔结构件 其中 所述的修复细胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组 合 其包括胚胎干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨 髓和外周血等 0055 c 任选地 对上一步骤中所述接种有修复 细胞的多孔结构件进行培养处理 使得接种的修复细胞进行增殖和 传代 从而获得经培养处理的多孔结构件 0056 其中 所述接种 有修复细胞的多孔结构件或经培养处理的多孔结构件即为本发明第 一方面所述的生物补片材料 0057 在另一优选例中 所述生物补片材料还可以用如下方法制备 0058 i 提供具有第一孔隙度A1的第一结构层 弹性蛋白基的结构层 和具有第二孔隙度A2的第二结构层 弹性蛋白基的结构层 以及 0 059 i i 将所述的第一结构层 弹性蛋白基的结构层 和第二结构层 弹性蛋 白基的结构层 与任选的其他结构层 如中间结构层 复合在一起 形 成未接种修复细胞的多孔结构件 0060 i i i 将所述修复细胞接种于上一步骤得到的多孔结构件 从而形成本 发明第一方面所述的生物补片材料 说明书106552294A64 8页7 0061 在另一优选例中 所述方法还包括 在步骤 a 之前的制备所述多孔结构件的步骤 0062 a1 提供一混合 物 所述混合物含有弹性蛋白 赖氨酸交联剂 粘多糖和惰性溶剂 如磷酸盐缓冲液 0063 a2 对上一步骤所述的混合物进行压模成 型 形成具有所述第一多孔结构层和第二多孔结构层的多孔结构件 0064 在另一优选例中 所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量比为5 0 xx 10 较佳地 80 150 4 8 更佳地 100 5 73 0065 在另一优选例中 所述步骤 a2 的成型温度为20 50 较佳地为30 40 如37 2 0066 在另一优选例中 所述步骤 a2 的成型时间为3 48小时 较佳地6 20h 0067 在另一优选例中 所述混合物的pH值为7 2 7 4 0068 在另一优选例中 所述混合物中含有磷酸盐缓冲组分 0069 在另一优选例中 在步骤 c 中 所述培养处理在培养箱中进行 0070 在另一优选例中 所述步骤 b 中 所述修复细胞的接种量为 1 102 1 105个 mm3 较佳地 5 102 5 104个 mm3 更佳地 1 103 1 104个 mm3 按第二多孔结构层的体积计 0071 本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的生物补 片材料的用途 用于制备治疗心脏疾病的医用补片 0072 在另一优选例中 所述的心脏疾病缺血性心力衰竭 包括冠 心病 心肌梗死后心力衰竭等 0073 应理解 在本发明范围内中 本发明的上述各技术特征和在 下文 如实施例 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合 从 而构成新的或优选的技术方案 限于篇幅 在此不再一一累述 附图说明 0074 图1显示了成型弹性蛋白基质的外观 0075 图2显示了扫描电镜下多孔结构层的第二结构层的孔隙度 0076 图3显示了扫描电镜下多孔结构层的第一结构层的孔隙度 0077 图4显示了扫描电镜下多孔结构层两层结构的孔隙度的区别 0078 图5显示了接种心脏干 祖细胞的补片材料固定切片后 细胞 渗透入补片第二层结构的空隙中的情况 具体实施方式 0079 本发明人经过广泛而深入的研究发现 将弹性 蛋白 赖氨酸交联剂 粘多糖等混合 压模 成型 形成弹性类蛋 白基 elastin based 的基质层 之后通过特定形态模具和温度来控制交联剂和蛋 白反应合成多层的生物补片材料结构 该生物补片材料可负载心脏 干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎干细胞 诱导性 多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 的生长 并具有 非常良好的生物相容性和机械强度 说明书106552294A75 8页8 0080 多孔结构层 0081 如本文所用 所 述 多孔结构层 包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层 和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结构层 其中 所述的修复细胞选自下组心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组 合 其包括胚胎干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨 髓和外周血等 其中 第一结构层具有第一孔隙度A1 第二结构层具有第二孔隙度A 2 并且 A2大于A1 具体地 A1为1 10 m 较佳地为2 6 m A2为20 200 m 更佳地为25 100 m A2 A1 5 较佳地 8 更佳地 10 0082 本发明所述的多孔结构层中 第一结构层的厚度为0 01 0 05cm 较佳地为0 01 0 02cm 所述的第二结构层的厚度为0 05 0 5cm 较佳地 0 1 0 25cm 0083 在一优选实施方式中 所述多孔结构层由具有相同或不同材 质的所述的第一结构层和所述的第二结构层构成 其中多孔结构层 的材质优选为生物可降解材料 0084 在一优选实施方式中 所述的多孔结构层含有由赖氨酸交联 剂 如BS3 交联在一起的以下组分 0085 a 弹性蛋白原 弹性蛋白 或其片段 和 0086 b 粘多糖 0087 在一优选实施方式中 所述的多孔结构层由交联在一起的上 述组分 a 和组分 b 构成 0088 在一优选实施方式中 所述的第一多孔结构层和 或第二多孔 结构层中 按相应结构层的体积计 各组分的含量如下 0089 弹性 蛋白的含量为5 200mg cm3 较佳地 1 150mg cm3 更佳地 50 100mg cm3 0090 粘多糖的含量为0 1 100mg cm3 较佳地 1 50mg cm3 更佳地 10mg cm3 0091 在一优选实施方式中 所述第二结构层面向需修复的心脏部 位 或组织 具体地 所述的第二结构层朝向心脏 而所述的第一 结构层朝向心包膜侧 0092 多孔结构件及其制备 0093 如本文所用 所述 多孔结构件 包括至少二个复合在一起的多孔结构层 所述的多孔结构层包括 用于阻挡或防止炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载 或容纳 用 于修复心脏的修复细胞的第二结构层 0094 所述多孔结构件用如下方法制备 0095 a1 提供一混合物 所述混合物含有弹性蛋白 赖氨酸交联剂 粘多糖和惰性溶剂 如磷 酸缓冲液 0096 a2 对上一步骤所述的混合物进行压模成型 形 成具有所述第一多孔结构层和第二多孔结构层的多孔结构件 0097 在一优选实施方式中 所述弹性蛋白与赖氨酸交联剂的重量 比为50 xx 10 较佳地 80 150 4 8 更佳地 100 5 73 0098 生物补片材料及其制备 0099 如本文所用 术语 生物补片 材料 是指用于制备医用补片 如心脏补片 的一种多层复合材料 具体地 所述生物补片材料的形状与需修复的心脏部位的形状相匹 配 并且所述补片材料包括 0100 i 至少二个复合在一起的多孔结 构层 所述的多孔结构层包括用于阻挡或防止说明书106552294A86 8页9炎性细胞渗透的第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏 的修复细胞的第二结构层 其中所述的修复细胞选自下组心脏干细 胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎干细胞 诱导性多能 干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 和 0101 i i 负载于所述第二结构层的所述的修复细胞 并且至少一部分或全 部所述的修复细胞位于所述第二结构层的空隙中 0102 本发明所述的生物补片材料用如下方法进行制备 0103 a 提 供一多孔结构件 所述的多孔结构件包括至少二个复合在一起的多 孔结构层 所述的多孔结构层包括用于阻挡或防止炎性细胞渗透的 第一结构层和用于负载 或容纳 用于修复心脏的修复细胞的第二结 构层 和 0104 b 将所述的修复细胞接种于所述第二结构层 形成 接种有修复细胞的多孔结构件 其中所述的修复细胞选自下组心脏 干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎干细胞 诱导性 多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 0105 c 任 选地 对上一步骤中所述接种有修复细胞的多孔结构件进行培养处 理 使得接种的修复细胞进行增殖和传代 从而获得经培养处理的 多孔结构件 0106 其中 所述接种有修复细胞的多孔结构件或经 培养处理的多孔结构件即为本发明所述的生物补片材料 0107 在本发明中 适合用作本发明修复细胞的心脏干细胞 心脏 祖细胞没有特别限制 可以哺乳动物 包括人和非人哺乳动物 典型地 这些心脏干细胞和心脏祖细胞可以用本领域的常规方法获 得 例如参见申请号为xx80040364 1 xx10241630 7 xx10141965 3 xx10376913 8中所公开的方法 或通过市售途径获得 或从保藏 机构获得 0108 在一优选实施方式中 所述步骤 b 中 所述修复细胞的接种 量为1 102 1 106个 mm3 较佳地 5 102 2 105个 mm3 更佳地 1 103 1 105个 mm3 按第二多孔结构层的体积计 并且 所述修复细胞人或非人哺乳动物 0109 在一优选的实施方式中 所述生物补片材料还可以用如下方 法制备 0110 i 提供具有第一孔隙度A1的第一结构层 弹性蛋白基 的结构层 和具有第二孔隙度A2的第二结构层 弹性蛋白基的结构层 以及 0111 i i 将所述的第一结构层 弹性蛋白基的结构层 和第二结构层 弹性蛋 白基的结构层 与任选的其他结构层 如中间结构层 复合在一起 形 成未接种修复细胞的多孔结构件 0112 iii 将所述修复细胞接种 于上一步骤得到的多孔结构件 从而形成本发明所述的生物补片材 料 0113 BS3 0114 如本文所用 术语 BS3 与 bi s sulfosuinimidyl suberate 可互换使用 是一种同基双功能试剂 homobifuctional agent 属于赖氨酸交联剂的一种 具有水溶性 不被水解 交联 氨基 不能穿透细胞膜等特点 被广泛应用于以下几个方面的研究 细胞膜结构 蛋白质结构 蛋白质间相互作用 生物导弹 载体蛋 白与半抗原的连接 蛋白质或其他分子的固相化 抗体的标记 标 记转移 蛋白质与核酸的连接等 0115 在本发明中 BS3能够将弹性蛋白交联到一起 形成交联的弹 性蛋白 说明书106552294A97 8页10 0116 用于心脏修复的试剂盒 0117 如 本文所用 所述的 用于心脏修复的试剂盒 包括 0118 一容器 以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的生物补片材料 0119 医用补片 0120 如本文所用 术语 医用补片 是指用本发 明所述的生物补片材料制备的一种制品 具体地 该制品包括心脏 补片 用于治疗缺血性心力衰竭 0121 本发明的主要优点包括 0122 1 本发明的生物补片材料以人类及非人哺乳动物的弹性蛋白为主要 材料 对细胞组织毫无毒害 没有免疫原性的问题 具有良好的生 物相容性 0123 2 本发明提供了一种全新 高效的促进梗死心肌再生和修复的治疗 方法将干细胞和 或祖细胞添加或接种到生物补片材料中 形成心脏 补片 该方法在加强心脏病变部位保护和机械强度的同时 还给予了包括 心肌 血管和间质在内的损伤结构一个极佳的修复环境和动力 0124 3 本发明的生物补片材料具有很高的机械强度 可以避免组织周遭 环境中炎症细胞的入侵 并且可以随着病情的恢复逐渐被病理部位 吸收和降解 0125 4 本发明的生物补片材料是一种多层结构 其中第一层结构的孔隙 度A1较小 对于炎性细胞是不可渗透的 第二层孔隙度A2较大 可 渗透和容纳心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎 干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干细胞 骨髓和外周血等 该结构能够更好的阻止炎症细胞入侵 并让细胞得到更好的生长和 分化 0126 下面结合具体实施例 进一步阐述本发明 应理解 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围 下列实施例中未注明具体条件的实验方法 通常按照常规条件如Sam brook等人 分子克隆实验室手册 New York Cold SpringHarbor LaboratoryPress 1989 中所述的条件 或按照制造厂商所建议的条 件 除非另外说明 否则百分比和份数按重量计 0127 实施例1多孔结构层的制备 0128 将弹性蛋白溶解于磷酸缓冲 液PBS 10mM磷酸钠 150mM氯化钠 pH7 4 中 形成浓度为100mg ml 的溶液 在溶液中添加浓度为10毫克每毫升的粘多糖 如肝素 最 后添加赖氨酸交联剂 如bis sulfosuinimidyl suberate 至10mM 迅速混匀 将准备好的溶液缓慢加入相应的模具 把模具转移至37 培养箱中 静置16小时 直至成型 图1 从而制得由第一结构层和第二结构层 组成的多孔结构层 并且 如图4所示 第一结构层与第二结构层的 孔隙度不同 0129 实施例2生物补片材料孔隙度的检测 0130 用扫描电子显微镜 SEM 和微型CT扫描对生物补片材料进行纵横方向多层的切面观察 0131 如图2和3所示 第一孔隙度A1为1 10 m 第二孔隙度A2为20 200 m 第二孔隙度A2与第一孔隙度A1之比A2 A1 5 较佳地 8 更佳地 10 并且 第一结构层的厚度为0 01 0 05cm 第二结构层的厚度为0 05 0 5cm 较佳地 0 1 0 25cm 生物补片材料的主表面积为10 80cm2 较佳地为25 55cm2 0132 结果表明 第一结构层的孔隙度A1较小 能防止修复细胞流 失 并且还可以防止说明书106552294A108 8页11炎性细胞渗透 第 二层孔隙度A2较大 可负载或容纳心脏干细胞 心脏祖 前体 细胞 或其组合 其包括胚胎干细胞 诱导性多能干细胞 心脏的组织干 细胞 骨髓和外周血等 该结构能够更好的阻止炎症细胞入侵 并让细胞得到更好的生长和 分化 0133 实施例3生物补片材料的机械性能测试结果 0134 用单轴压缩 舒张测试