实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 - 副本 (2)

本科学生实验报告本科学生实验报告 学号 124120463 姓 名 学院 生命科学学院 专业 班级 12 级生物技术班 实验课程名称 酶工程实验一 教 师 吴倩 云南师范大学教务处编印 实验一实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一 目的要求 1 掌握从土壤中分离酶产生菌的方法 学会应用微生物生态知识分离产酶微生 物 2 掌握淀粉酶活性测定的原理 学会淀粉酶活性的测定方法 二 基本原理 一 淀粉酶产生菌的分离 1 菌种的采集 要获得产生某种酶的菌种 可从富含该酶作用底物的场所去采集 胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致 因此要筛 选具有某一特性的酶时 只要到相应的环境中采样即可 2 富集培养 原理 采集到的样品中如果所需的菌很少 需要先经过富集培养 使所需 的菌大量繁殖 而不需要的菌则不生长或少生长 以利于筛选 富集的方法 控制培养的温度 pH 和营养成分等 3 菌种的分离 淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物 淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖 而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物 结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈 从而筛选出淀粉酶产生菌 二 淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1 原理 根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖 还原糖与 3 5 二硝基水杨酸 共热后被还原成棕红色的氨基化合物 在一定的范围内 还原糖的量和反应 液的颜色呈比例关系 可利用比色法在 540nm 进行测定 2 酶活定义 在一定 pH5 5 37 条件下 每分钟内从底物溶液中分解释放 1 mol 葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位 U g 酶活计算公式 酶活 U g A 5 K N 1000 T W A 样品的 OD 值 平均值 K 标准曲线的斜率 N 稀释倍数 5 0 2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T 反应时间 min 1000 转换因子 1mmol 1000 mol W 葡萄糖的分子量 180 2g mol 3 绘制标准曲线 先配制一系列浓度不同的标准溶液 用选定的显色剂进行显色 在一定波 长下分别测定它们的吸光度 A 以 A 为横坐标 浓度 c 为纵坐标 则得到一条拟合度较好的直线 称为 标准曲线 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度 便可从标准曲 线上找出对应的被测溶液浓度或含量 三 器材 1 试剂 可溶性淀粉 碘 碘化钾 HCl 柠檬酸 Na2HPO4 12H2O 等 2 培养基 分离 纯化培养基 3 仪器 平皿 三角瓶 大试管 1mL 和 10mL 移液枪 涂棒 天平 超净工作台 培养箱 电冰箱 恒温调速摇瓶柜 离心机 恒 温水浴锅 紫外分光光度计 比色皿 记时器 高压灭菌锅 四 操作步骤 一 淀粉酶产生菌的分离 1 培养基的配制及灭菌 倒平板配制分离培养基 高压灭菌 30min 冷却至约 50 倒 7 块平板 140mL 冷却备用 2 制备土壤稀释液 称取土样 1g 放入 9mL 无菌水试管中 摇动 10min 静置 10min 制备 得到 10 1 土壤稀释液 用无菌吸管吸出 1mL 土壤悬液 加入盛有 9mL 无菌水的大试管中 充分 混匀 制备得到 10 2 土壤稀释液 再从中吸出 1mL 加入盛有 9mL 无菌水的大试管中 混匀后得到 10 3 土 壤稀释液 以此类推 分别制备得到 10 4 10 5 10 6 10 7 土壤稀释液 3 涂布 用无菌吸管分别吸取 10 3 10 4 10 5 10 6 和 10 7 土壤稀释液各 0 1mL 对号放入已经写好记号的平板中央 用无菌玻璃涂棒涂匀 4 培养纯化 挑取其中透明圈较大的单菌落 划线于平板 37 倒置培养 2 3d 如发现 杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养 5 产淀粉酶微生物的鉴定 向平板内加入稀碘液数滴后进行观察 二 淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1 淀粉酶产生菌的发酵 分离培养基 140mL 的配制 可溶性淀粉 0 7g 蛋白胨 0 7g 酵母膏 0 7g KH2PO4 0 07g MgSO4 7H2O 0 02g CaCl2 2H2O 0 08g 琼脂 2 8g 配置发酵培养基 200mL 组 40mL 瓶 将纯培养得到的 透明圈 最大的 菌落接种于发酵培养基中 30 150r min 摇瓶发酵 约 72h 2 葡萄糖标准曲线的制作 精确称取 0 100g 葡萄糖 用缓冲溶液定容至 100ml 制得浓度为 1mg ml 的葡萄糖的标准溶液 标准曲线如下图表所示 葡萄糖标准溶液 体积 ml 0 00 20 40 60 81 01 2 葡萄糖含量 mg 0 00 20 40 60 81 01 2 缓冲液 ml 2 01 81 61 41 21 00 8 DNS ml 3333333 定容总体积 ml 15151515151515 OD 540nm 待测酶液的制备 a 将发酵液倒入离心管中离心 离心条件 4000 转 5 分钟 将离心后的上 清液倾入试管中 稀释一定倍数测定其酶活力 b 底物溶液 2 淀粉溶液 需当天配置 称取 2 0 克可溶性淀粉 用约 80mL 缓冲液调匀 加热煮沸直到淀粉完全 溶解 冷却 并用缓冲液定容至 100mL 注 如果测定所得 OD 值不在有效值 0 2 0 8 范围内 则相应地降低或 增大稀释倍数后再进行测定 淀粉酶酶活测定方法 操作步 骤 空白管样品管 A样品管 B 步骤 1吸取 1 8mL 可溶性底物溶液 吸取 1 8mL 可溶性底 物溶液 吸取 1 8mL 可溶性 底物溶液 步骤 237 保温 5 分钟37 保温 5 分钟37 保温 5 分钟 步骤 3 加入待测酶液 0 2 毫 升 加入待测酶液 0 2 毫升 步骤 437 精确保温 15min37 精确保温 15min37 精确保温 15min 步骤 5加入 3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止 反应 加入 3mLDNS 试剂 终止反应 步骤 6混合均匀混合均匀混合均匀 步骤 7加入 0 2 毫升待测酶液 沸 水浴煮沸 5min 沸水浴煮沸 5min沸水浴煮沸 5min 步骤 8流水冷却流水冷却流水冷却 步骤 9加蒸馏水 10mL 混匀加蒸馏水 10mL 混匀 加蒸馏水 10mL 混 匀 步骤 10 OD540nm 比色OD540nm 比色OD540nm 比色 五 酶活测定注意事项注 1 试管上编号 贴上用圆珠笔写上编号的胶布 以防止保温或沸水加热时脱 落 2 移液枪的使用 向试管内加入待测酶液或 DNS 时 枪头不要触碰管壁 也 不要伸入液面下 连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头 3 精确记时 每一管加入酶液的时间要做记录 每管之间间隔的时间要合理 4 避免试管进水 煮沸和用流水冲洗时 5 实验结果的记录与分析 六 实验报告 一 淀粉酶产生菌的分离结果 筛选 结果 稀释 倍数 产淀粉酶菌落 数 菌落形态 透明圈 大小 10 3 6 菌落疏松 呈绒毛状 絮 状 蜘蛛网状 大多为白 色 有的为淡黄色和黑色 1 1cm 1 0cm 0 9cm 0 8cm 0 5cm 3cm 10 4 1 绒毛状 圆形 白色 0 8cm 10 51 絮状 白色 0 9cm 10 61 絮状 淡黄色 0 5cm 10 7 0 二 葡萄糖标准曲线绘制 葡萄糖标准曲线的制作 编号 123456 葡萄糖含量 0 20 40 60 81 01 2 OD 540nm 0 0840 2850 4910 7180 9221 133 糖化酶活力测定结果 葡萄糖标准曲线 y 0 9479x 0 126 R2 0 9998 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 00 20 40 60 811 2 OD 葡萄糖含量 mg ml 系列1 线性 系列1 编号样品管 A样品管 B OD 540nm 0 3320 289 糖化酶活力的计算 OD 的平均值 A B 2 0 332 0 289 2 0 3105 根据酶活计算公式 酶活 U g A K b N 1000 T W 5 A 样品的 OD 值 平均值 K 标准曲线的斜率 N 稀释倍数 5 0 2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T 反应时间 min 1000 转换因子 1mmol 1000 mol W 葡萄糖的分子量 180 2g mol 代入数据可得 酶活 U g A K b N 1000 T W 5 0 3105 0 9479 0 126 1 1000 15 180 2 5 0 7775 3 思考题 请你建立一个 筛子 从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物 答 采集土样 除土层表面枯枝 杂草和砂石 收集距表层 5cm 10cm 土壤 将采集的土样进行 10 1 10 6 梯度稀释后 分别涂布于改良的含溴甲酚绿 的植酸钙平板初筛培养基