基因测序技术概述

精品文档 1欢迎下载 基因测序技术概述 摘要 基因测序技术是一种发展迅速和应用广泛的现代分子生物学技术之一 本文基于国内外基因测序技术的发展现状 综合评述了四代基因测序技术 归 纳了它们各自的特点与优缺点 以及应用现状 范围及其在实际应用中的优势 和不足 总结了当前出现的基因测序新方法 并对该项技术的发展趋势进行展 望 关键词 基因测序技术 发展 应用 前景 Abstract Gene sequencing technology is a kind of modern molecular biology techniques with rapid development and wide application In this paper it is based on the current development of gene sequencing technology at home and abroad a comprehensive review is given on the four generations of gene sequencing technology it sums up their respective characteristics advantages and disadvantages as well as their application about status scope and its advantages and disadvantages in practical application it summarizes the new gene sequencing method and points out the development trend of itself Key words Gene sequencing technology Development Application Prospects 精品文档 2欢迎下载 基因测序技术 又 称DNA 测序技术 是分子生物学研究中最常用的 技术 它的 出现极大地推动了生物学的发展 成熟 该技术始于 20 世纪70 年代 中期 1977 年 Maxam 和 Gilbert 报道了通过化学降解测定 DNA 序列的方法 1 同一时期 Sanger 发明了双脱 氧链终止法 20世纪 90 年代初出现的荧光自 动测序技术将 DNA 测序带入自动化测序的时代 这些 技术统称为第一代 基因测序技术 最近几年发展 起来的第二代基因测序技术则使得DNA 测序进入了高通量 低成本的时代 目前 基于单分子读取 技术的第三代测序技术已经出现 该技术测定DNA 序列更快 并有 望进一步降低测序成本 2 第一代 DNA 测序技术包括传统的化学降解法 双脱氧链终止法 基于 Sanger 原理而发展的荧光自动测序技术 以及杂交测序技术等 3 随着人类基 因组计划的完成 进入功能基因组时代后 传统的第一代测序技术不足以满足 深度测序和重复测序等的需求 因而促进了新一代测序技术的发展 第二代测 序平台包括 454 测序技术 Solexa 技术和 SOLID 测序技术 第三代测序技术是 精品文档 3欢迎下载 在第二代测序基础上增加读长 提高了测序效率 降低了成本 三代主要是单 分子测序 能直接对 RNA 和甲基化 DNA 序列进行测序 4 第四代测序技术为纳 米孔测序技术 具有长读长 高通量 低成本和短耗时的优势 5 目前 四代 测序技术在各项研究领域中均有所应用 未来测序技术将会发挥更大的作用 1 1 国内外基因测序技术国内外基因测序技术 1 1 第一代测序技术 1 1 1 化学降解法 1977 年 Gilbert 等提出了化学降解法 在该方法中 一个末端被放射性标 记的 DNA 片段在五组相互独立的化学反应中分别被部分降解 其中每一组反应 特定地针对某种碱基 因此生成五个特异性标记的分子 每组混合物中均含有 长短不一的 DNA 分子 长度取决于该组反应所针对的碱基在原 DNA 片段的位置 最后 各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离 再通过放射自显影来检 测末端标记的分子 6 化学降解法刚提出时 因准确性及易掌握性使用比较广泛 而且化学降解 法有一个独特的优点即用原 DNA 分子进行测序而不是酶促合成产生的拷贝 排 除了合成时造成的错误 但由于操作复杂 之后被 Sanger 法所代替 1 1 2 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法又称 Sanger 法 该方法的原理是 由于双脱氧核苷三磷酸 ddNTP 的 2 和 3 都不含羟基 在 DNA 反应中不能合成磷酸二酯键 因此可以 被用来中断 DNA 合成反应 7 核酸模板在 DNA 聚合酶 引物 四种单脱氧核苷 三磷酸 dNTP 其中的一种用放射性 P32 标记 存在条件下复制时 在四管反应 系统中 分别按比例引入四种 ddNTP 因为双脱氧核苷没有 3 OH 所以只要双脱 氧核苷渗入链的末端 该链就停止延长 若链端掺入单脱氧核苷 链就可以继 续延长 如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为 3 端的一系列长度 不等的核酸片段 反应终止后 分四个泳道进行凝胶电泳 分离长短不一的核 酸片段 长度相邻的片段相差一个碱基 经过放射自显影后 根据片段 3 端的 双脱氧核苷 便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序 图 1A Sanger 法因操作简便 得到广泛的应用 后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术 其中最重要的是荧光自动测序技术 1 1 3 毛细管电泳和荧光测序 荧光自动测序技术基于 Sanger 原理 用荧光标记代替同位素标记 并用成像 系统自动检测 从而大大提高了 DNA 测序的速度和准确性 在 1990 年 毛细管 凝胶电泳 质谱测序技术被 Zagursky 和 McCornick 建立 毛细管凝胶电泳技术 精品文档 4欢迎下载 将凝胶电泳对大分子的高分辨率与毛细管电泳的快速微量相结合 电泳中凝胶 的抗对流性大大提高了分辨率 目前 应用最广泛的美国应用生物系统 Applied Biosystems ABI 公司的 3730 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳 和荧光标记技术的 DNA 测序仪 8 9 1 1 4 杂交测序技术 杂交测序是 20 世纪 80 年代末出现的一种测序方法 该方法不同于化学降 解法和 Sanger 法 而是利用 DNA 杂交原理 将一系列已知序列的单链寡核苷酸 片段固定在基片上 把待测的 DNA 样品片段变性后与其杂交 根据杂交情况排 列出样品的序列信息 杂交测序检测速度快 采用标准化的高密度寡核苷酸芯 片能够大幅度降低检测的成本 具有部分第二代测序技术的特点 但该方法误 差较大 且不能重复测定 第一代测序法准确率高和读长长 适合对新物种进行基因组长距离的框架 构建及测序长度 KB MB 级别的小规模项目 可用于已知或未知的基因突变检测 常被用作标准的鉴定方法以及最终确定突变的确切位点与突变性质的手段 该 法特别适用于单基因病的基因诊断和产前诊断 10 但其通量小 只能逐段测序 即只能分析单个的 DNA 片段 无法完成全基因组层面的分析 且测序成本高 数据分析量大 自动化程度不高或需手工操作 第一代测序技术 不管是 Sanger 的双脱氧链终止法还是 Maxam 和 Gilbert 的化学裂解法 都需要放射性同位素标记 操作繁琐且不能自动化 故无法满 足大规模测序的要求 另外 毛细管微阵列DNA 测序在成本与耗时方面亦无法 满足基因组学的发展需要 11 12 1 2 第二代测序技术 高通量测序技术 又名二代测序或深度测序 可以一次性测定几十万甚至 几百万条序列 是传统测序技术的一次革命 主要有454测序平台和Solexa测序 平台 高通量测序技术属于一类循环阵列合成测序的技术群 这类技术首先都 是将基因组DNA随机片段化并制备文库 通过对数以万计克隆阵列的延伸反应产 生信号的检测 最终获取测序的信息 该技术有两个方面的突出优势 其一 通过使用微阵列配置实现大规模的并行化测序 提高测序效率 其二 无需电 泳分离过程和细菌转染 质粒制备等克隆过程 设备趋于微型化 从而降低了 各环节的成本 节省了时间和人力 该技术的发展使人类对各种病原或物种遗 传多样性的评价达到了前所未有的详细程度 它已成为现代科研中必不可少的 技术之一 第二代测序技术最显著的特征是高通量 一次能对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测序 方便了对一个物种的转录组测序或基因组深度测序 13 高 通量测序技术进入市场 使 DNA 测序技术在 2005 年发生了重要转折 改变了测 精品文档 5欢迎下载 序的规模化进程 瑞士罗氏 Roche 公司和美国应用生物系统 Applied Biosystems ABI 公司都推出了各自的新一代 DNA 测序仪 主要技术革新有以 下几点 采用矩阵分析技术 实现了大规模并行化 使得矩阵上的 DNA 样本可 以被同时并行分析 不再采用电泳技术 使得 DNA 测序仪得以微型化 测序成 本大大降低 边合成边测序 测序速度大幅提高 图 1B 14 1 3 第三代测序技术 第三代测序技术是高通量 单分子测序 单分子测序仪被应用于第三代的 测序 图 1C 太平洋生物科学 Pacific Biosciences 公司的单分子实时测 序 SMRT 技术和牛津纳米孔公司正在研究的纳米孔单分子测序技术逐渐向着 高通量 低成本 长读取长度的方向发展 不同于第二代测序依赖于 DNA 模板 与固体表面相结合 然后边合成边测序 第三代分子测序不需要进行 PCR 扩增 15 16 单分子实时测序 SMRT 测序技术是先将 DNA 聚合酶固定在测序芯片的反 应孔底部 当加入的 DNA 测序单链进入反应孔被 DNA 聚合酶捕获后 四种不同 荧光标记的 dNTP 加在反应孔的上端 根据标记荧光基团发射波长的不同 可以 识别延伸的碱基种类 21 22 1 4 第四代测序技术 第四代测序技术 即纳米孔测序技术 该方法不同于其他测序方法 不需要对 DNA 进行生物或化学处理 而采用物理办法直接读出 DNA 序列 原理可以简单的 描述为 单个碱基通过纳米尺度的通道时 会引起通道电学性质的变化 理论上 A C G T 四种不同的碱基化学性质的差异会导致它们穿越纳米 孔时引起的电学参数的变化量也不同 对这些变化进行检测可以得到相应碱基的 类型 目前用于 DNA 测序的纳米孔可以大致分为两类 生物纳米孔和固态纳米 孔 典型的生物纳米孔和固态纳米孔的结构如图 1D 所示 由于 DNA 链的直径非 常小 双链 DNA 直径约为 2nm 单链 DNA 直径约为 1nm 所以对所采用的纳米孔的 尺寸有着近乎苛刻的要求 生物纳米孔多采用的是溶血素 一般嵌入在双层脂膜 当中 其最窄处直径尺寸约为 1 5nm 恰好允许单链 DNA 分子通过 并且大小严 格一致 然而生物纳米孔在膜稳定性 电流噪声等方面的问题 在一定程度上 限制了其发展 牛津纳米孔公司在蛋白纳米孔的应用方面取得了一定进展 他 们的 Grid ION 和 Min ION 系统就是基于蛋白纳米孔的测序平台 固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成 一般使用离子束或电子束 在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞 再进一步对孔的形状和大小进行 修饰而成 相比于生物纳米孔 固态纳米孔在稳定性 电流噪声 工艺集成方 面有着显著的优势 但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平 固态纳米孔的 制造还较为复杂与昂贵 精品文档 6欢迎下载 纳米孔测序的优点十分明显 与前几代技术相比在成本 速度方面有着很 大优势 但是目前还处在起步阶段 从测序原理到制造工艺都存在许多问题 例如 研究者们在实验中遇到的一个普遍问题就是 DNA 分子的运动难以控制 还有纳 米孔的表面性质 如表面粗糙度 电荷分布 电荷密度 亲水疏水特性等 会对 DNA 分子的运动 噪声信号大小产生很大影响 这时就需要选择合适的材料对纳 米孔进行表面修饰 这也有待更好的研究发现 目前还有相当多的困难 许多 技术也都只停留在理论阶段 距离真正的商业化应用还有很长一段路要走 图 1 A 双脱氧链终止法测序 在四管反应系统引入 ddNTP 每管反应体系合成长度不等的 核酸片段 之后进行凝胶电泳 经过放射自显影 根据片段 3 端的双脱氧核苷 便可依次 阅读合成片段的碱基排列顺序 B 454 测序 采用矩阵分析技术 使得矩阵上的 DNA 样本 可以被同时并行分析 C 单分子测序仪 工作时先将 DNA 聚合酶固定在测序芯片的反应孔 底部 DNA 聚合酶捕获加入的 DNA 测序单链 四种不同荧光标记的 dNTP 加在反应孔的上端 根据标记荧光基团发射波长的不同 可以识别延伸的碱基种类 D 生物纳米孔和固态纳米 孔的结构 a 溶血素 溶血素内孔径大小刚好允许单链 DNA 分子通过 是十分理想的纳米 精品文档 7欢迎下载 孔材料 b 固态纳米孔 根据采用的工艺不同 纳米孔的几何形状和尺寸也有所不同 一般用 于 DNA 测序的纳米孔直径要求小于 5 nm 2 2 基因测序技术应用基因测序技术应用 测序技术有利于我们更好地进行科学研究 第一代 DNA 测序技术就在人类 基因组计划中有着至关重要的作用 加快了人类基因组计划的实现 17 其作为 早期测序技术有着自身优缺点 现如今还在被人们使用 但随着第二代测序技 术的出现 用第二代测序技术解决科学问题成为更普遍的事情 当今 高通量 测序开始在寻找疾病的候选基因上应用广泛 第二代测序技术使得核酸测序的 单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降 测量通量明显提高 18 因此 第 二代测序技术加快了基因组研究的进展步伐 让所有实验室皆可开展基因组测 序工作 目前 一些测序技术被主要应用于科研院所 企业研发部门等 例如 半 导体测序是通过检测 DNA 链在延伸的过程中产生的 H 实现边合成边测序 19 20 HeliScope 测序技术是基因组 DNA 经过剪切 多聚腺苷酸加尾并固定于测 序芯片表面后 A C G T 四种荧光修饰的 dNTP 依次循环流加至芯片上 当 碱基互补延伸后 采集荧光信号获得碱基信息 之后酶切去除荧光基团 随之 进行下一轮反应 纳米孔测序技术利用镶嵌于脂质双分子层中的经过基因工程 改造过的 溶血素蛋白作为纳米孔道 并在 溶血素蛋白孔道上部和中部分 别连接一个核酸外切酶和一个氨基化环糊精配体 在测序反应开始时 核酸外 切酶逐个切割单链 DNA 分子上的脱氧核糖核苷酸分子 切割后的脱氧核糖核苷 酸分子进入纳米孔 经过氨基化环糊配体时 将会引起电流的变化 由于四种 精品文档 8欢迎下载 脱氧核糖核苷酸与甲基化嘧啶脱氧核糖核苷酸引起电流变化幅度不同 从而可 以区分不同的碱基 进而测定 DNA 链的序列 作为新兴的第四代 DNA 测序技术 具有低成本 高读长 易集成等优势 如今 随着半导体工艺技术的飞速发展 小型化 高速度 大通量的纳米孔测序芯片的实现成为可能 目前 具代表性的第二代测序平台有瑞士罗氏 Roche 公司的 454 美国 Illumina 公司的基因组测序仪 HiSeq2000 和 MiSeq 美国应用生物系统 Applied Biosystems ABI 公司的寡聚物连接检测测序 5500XL 美国生命科技 Life Technologies 公司半导体测序个人化操作基因组测序仪 表 1 第 三代测序平台有美国螺旋生物科学 Helicos Biosciences 公司的 Heli Scope 遗传分析系统和太平洋生物科学 Pacific Biosciences 公司的单分子 实时测序 SMRT 技术 第四代测序技术有英国牛津纳米孔 Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔测序技术 25 表 1 公司名称技术原理商业模式 Illumina 合成测序测序仪 试剂耗材销售 测序及解读服务 Life Tech 基于磁珠的大规模并行链 接 DNA 测序 测序仪 试剂耗材销售 Roche 大规模并行焦磷酸合成测 序 测序仪 试剂耗材销售 2013 年停产 3 3 基因测序技术前景展望基因测序技术前景展望 基因测序技术的出现对生命科学和医学的发展起到了革命性作用 自 1977 年 Sanger 发明链终止双脱氧链终止法 Maxam 和 Gilbert 发明化学降解法的第 一代测序技术以来 基因测序技术不断发展 随着技术革新 DNA 测序技术得 到了不断的创新 在保证测序准确度的前提下 逐步优化操作程序 使得测序 速度逐渐提高 测序成本也呈下降趋势 下一代测序技术 Next generation sequencing NGS 就应运而生 23 NGS 技术又称大规模平行测序或深度测序 24 包括第二代 第三代和第四代测序技术 第三代和第四代测序技术目前处于发展阶段 虽读长比 Sanger 测序法长 十几倍 但 Pac Bio RS 单分子实时测序系统和 Min ION 测序仪错误率高 还 精品文档 9欢迎下载 有待改进 26 基因测序技术向将向更高通量 更高精度 更低成本的方向发展 测序速度达到 1 万个碱基 秒 测序成本不到 1000 美元的小型基因组测序仪呼 之欲出 一次并行测定数百种微生物的低价测序也不是梦想 更高通量与精度 更低成本的测序技术定会出现 全民个体化健康的时代也必将到来 27 基因测序技术对揭示基因组的结构和功能已经并正在发挥重要的推动作用 基因测序技术的日渐成熟 在功能基因组 系统生物学和药物基因组的研究中 将会发挥广泛作用 比如说 新一代基因测序技术能鉴定出更多新的与肿瘤相 关的基因 且成本更低 这为肿瘤的个体化基因治疗提供条件 28 29 此外 微 生物在调节人体的内分泌系统及免疫系统中发挥重要作用 30 随着基因测序技 术的发展 有望实现从基因水平及分子结构掌握其功能作用的机理 对今后的 健康管理有一定指导作用 总之 基因测序技术的发展无疑推动了生物 医疗 化学和计算机等多领域的发展 将使生命科学研究进入新的纪元 精品文档 10欢迎下载 参考文献参考文献 1 Maxam AM Gilbert W A new method for sequencing DNA Proc Natl A cad Sci USA 1977 74 2 5602564 2 Sanger F N icklen S Coulson AR DNA sequencing w ith chain2ter2 m inating inhibitors Proc Natl A cad Sci USA 1977 74 12 546 3 5467 3 解增言 林俊华 谭军 舒坤贤 DNA 测序技术的发展历史与最新进展 J 生 物技术通报 2010 08 64 70 4 Korlach J Turner S W Going beyond five bases in DNA sequencing J Curr Opin Struct Biol 2012 22 3 251 261 5 聂志扬 肖飞 郭健 DNA 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