疯牛病与朊病毒教学材料

疯牛病与朊病毒教学材料疯牛病与朊病毒教学材料 疯牛病与朊病毒遗传学车建花1986年 英国疯牛病1996 朊病毒 Pr ion 的发现 朊病毒的分子结构及生物学和致病性特性 朊病毒的致 病机理 朊病毒的 朊病毒的检测方法 疯牛病的防控措施 1957年 发现在新几内亚高地有食尸习俗的土著部族中流行一种震颤病 亦 称库鲁病 死者脑组织呈海绵状变性 之后 分别将kuru病和CJD死者的脑组织滤液接种于猩猩及猴均获得 成功 动物染病且病原传代 从而证实羊痒病 kuru病 CJD可能为 同一病原 1980年 美国神经学教授Prusine从患羊痒病的羊脑中提纯使接种 小鼠全部发病的传染因子 并确定该因子是不含核酸却能不停复制 而具传染性的奇特蛋白质粒子 他将该致病因子命名为prion 称此 蛋白为 Prion Protain 简称PrP 他因此获1997年诺贝尔医学生理学奖 到目前为止 由朊病毒引发的相关疾病主要有 由上表可知 由朊 病毒引发的疾病具有一些相似的临床症状共济失调 进行性痴呆等 此外 大部分患者脑部还具有相似的病理变化中枢神经系统中组织 淀粉样斑块变性 海绵状变性 星形细胞神经胶质增生 神经纤维网海绵状变性星形细胞胶质增生左图过碘酸希夫法染色的 额皮层切片 显示海绵样变性环绕的斑聚集区 93 右图多斑和无定形沉积物呈现PrP免疫阳性 460 朊病毒的 朊病毒根据其感染途径分为散发性 传染性和遗传性三种 散发性PrPc自发性转变为PrPsc 不需外源PrPsc 属偶然事件 遗传性PrP基因病理性突变遗传 如遗传性GSS 家族性CJD 传染性 医源性传染 血液传播 摄食患病的动物制品 BSE的 出现及新型CJD的发现 上图散发性 传染性阮病毒病 下图遗传性 阮病毒病朊病毒的结构 研究证明 PrP 实际上有良性 恶性之 分 Prusiner发现的可传染致病的PrP称PrPsc sc取自 scrapie 的前2 个字母 另一类是在人体内神经元等细胞膜表面也存在着的一种生 理性PrP 其原始一级结构 相对分子质量均与PrPsc完全相同 为 示区别 特命名为PrPc c取 cell 首字母 PrP的一级结构 均有约253 254个AA组成 为疏水性蛋白 其N端22 个AA为信号肽 第23 95处有一段富含甘氨酸和Cu2 等的5个8肽重 复区 第96 112氨酸为转录控制区 从113 136从为跨膜区 复制 关键区 在179 214处组氨酸残基间有1个二硫键连结 第136 2 31AA间有3个螺旋区 在C端第232AA残基可连结一个糖基磷脂酰肌醇锚 glycoyl phophatidylinositol GPI 插入胞膜 PrP的一级结构示意图N N端C C端PrP的二级结构 它们在立体结构上存在很大差别PrPc转化为PrPs c结构模式图PrPc的生物学功能 PrPc是将Cu2 等从胞外运入胞内的 跨膜转运载体蛋白 一般认为N端的8肽重复区是Cu的结合部位 不同pH条件下 结合能力不同 Cu2 是SOD组成部分 故PrP可保护 神经元免遭过氧化攻击 PrPc可调节神经细胞内钙离子浓度 而参 与其信号传导 PrPc有抑制脑内 一氨基丁酸 GABA 受体兴奋作用 缺如可致震颤 维持小脑皮层蒲肯野细胞活性 使机体不出现共 济失调和早熟死亡 促进T淋巴细胞成熟 活化过程 可能与其C端 的GPI锚有关 PrPsc的生物学特性 既能被某些可降解蛋白的处理方 法所破坏 又能部分抵抗蛋白酶 对核酸酶处理及紫外线照射均不敏感 PrPsc对热 辐射 酸碱和常规消毒剂有很强的抗性 PrPsc的致病性特性 感染后潜伏期长 数月至数年 宿主没有免疫 应答 不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能 没有发现炎症反应 慢性进行性病理变化 有淀粉样斑块 神经胶质增生等 疾病不会康 复或减轻 最终归于死亡 细胞不产生细胞病变 感染细胞内未发 现包涵体 对干扰素不敏感 不诱导细胞产生干扰素 没有发现传 染性核酸 不含非宿主蛋白 免疫抑制剂 免疫增强剂等不能改变 潜伏期和病程 PrPsc的致病机制 Prusiner等大量的研究指出 人和动物脑的退化 病的发病机制是由细胞内PrPc转变为PrPsc PrPsc聚集 最后导致 神经元 淀粉变性 Borchelt等 1990 发现朊病毒的增殖是一个指数增长的过程 目前 关于PrPsc的增殖机制有下面几种假说Prusiner的二聚体假 说 Lansbury的聚合作用假说及Fred等的构象模式假说 二聚体假说PrPc与PrPsc结合体 PrPc被PrPsc置换 形成2个PrPsc 分子 下一周期2分子PrPsc与2分子PrPc结合 置换后形成4分子PrP sc 感染就是PrPsc侵入 复制就是PrPc在PrPsc催化下 使PrPc变为PrP sc 聚合作用假说在聚合体中 以PrPsc为核心 外面包围PrPc PrPc 对形成聚合体是必要的 感染就是PrPsc进入PrPc中 PrPc转化为PrPsc的机制 PrPsc是PrPc的异构体 当发生感染时 Pr Pc中的 螺旋不断向 折叠转变 导致正常蛋白构象转变 形成 PrPsc 其转变可被紫外线 酸碱等因素所诱导 研究表明 PrPsc和PrPsc之间存在一个高能活化能垒 energy barrier 其自由能差 G 0 9KJ mol 因而使PrPsc向PrPc转化十 分困难 在PrPsc的二级结构中存在4个突变区 其中3个就位于 折叠上 这可能与PrPc的感染性 潜伏期密切相关 PrPsc易聚集的原因 Christopher提出有些蛋白容易聚集是因为结构 决定的 特别是 折叠的蛋白 PrPsc及淀粉样变蛋白都属于这种蛋白 两者容易聚集成为纤维 血液传播 近年研究证实 PrPc在人神经系统表达量最高 在外周淋 巴细胞 单核细胞 造血细胞也均有较高水平表达 在心脏 骨骼 肌 脾 胰 肾等组织中可检测到 在脑内 则以皮层 海马 纹状体和嗅球最为丰富 其次为中脑 丘脑和小脑 再次为脑干 在脑组织中广泛分布有PrP的受体 大量研究表明 在人的外周血PrP被T B淋巴细胞 杀伤细胞 NK 单核细胞和树突状细胞所表达 在血小板和血浆中数量最大 近年研究及临床发现 存在血液传播的可能性 防治措施 禁止大量进口牛 羊等动物及其肉制品 血制品 免疫制 品 动物蛋白饲料等 医疗器械尽量一次性使用 以防医源性传播 非一次性器械可浸泡在1M NaOH液中1h或132 以上高压消毒1h 因为煮沸 环氧乙烷 过乙酸 三氯甲烷 苯酚 甲醛 射线 紫外线等对PrPsc均无效 病牲畜头颅 尸体的最好处理办 法为焚烧 因为PrPsc在干枯的大脑中能生存2年以上 故对疑似或 确诊的病人 畜尸体均不宜作地下深埋处理 尽量不用牲畜组织提 取激素等药物 应改用化学合成的激素等 朊病毒的检测方法 免疫印迹分析法 ELISA法 双抗夹心法 夹心 免疫法 免疫荧光法免疫印迹法检测PrPsc 原理根据抗原抗体的特异 性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法 免疫印记法检测实例用大肠杆菌表达的牛朊病毒正常成熟蛋白免 疫新西兰白兔 获得了与朊蛋白 PrP 反应的抗体T1 根据致病型朊病毒 PrPsc 能抵抗蛋白酶消化的特性 用蛋白酶K消 化脑织提取物 以抗体T1进行免疫印迹反应 结果表明从接种羊瘙 痒病朊病毒的金黄地鼠脑组织提取物内检测到抗蛋白酶K消化的致病 型PrPsc 而正常金黄地鼠脑组织中没有抗蛋白酶消化的蛋白 ELISA法检测PrPsc 原理酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbentassay 简称ELISA 是在免疫酶技术 Immunoenzymati c techniques 上发展起来的一种新型免疫测定技术 过程抗原吸附在固相载体上 这个过程称为包被 加待测抗体 再 加相应酶标记抗体 生成抗原 待测抗体 酶标记抗体的复合物 再与该酶的底物反应生成有色产物 借助分光光度计的光吸收计算抗体的量 待测抗体的量与有色产物成正比 ELISA法分为四种直接法 间接法 双抗夹心法和竞争法 双抗夹心法 夹心免疫法使用两个单克隆抗