SOD_测定方法

SOD 氮蓝四唑 NBT 法测定超氧物歧化酶 SOD 活力 一 原理 超氧物歧化酶 superoxidedismutase SOD 普遍存在于动 植物体内 是一种清除超氧阴 离子自由基 O2 的酶 实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑 NBT 在光下的还原作用 来确定酶活性大小 在有氧化物质存在下 核黄素可被光还原 被还原的核黄素在有氧条 件下极易再氧化而产生 O2 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙 后者在 560nm 处有最大吸 收 而 SOD 可清除 O2 从而抑制了甲腙的形成 于是光还原反应后 反应液蓝色愈深 说明酶活性愈低 反之酶活性愈高 据此可以计算出酶活性大小 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 水稻或小麦叶片 二 仪器设备 1 高速台式离心机 2 分光光度计 3 微量进样器 4 荧光灯 反应试管 处照度为 4000Lx 5 试管或指形管数支 三 试剂 1 0 05mol L 磷酸缓冲液 pH7 8 2 130mmol L 甲硫氨酸 Met 溶液 称 1 9399gMet 用磷酸缓冲液定容至 100ml 3 750 mol L 氮蓝四唑溶液 称取 0 06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存 4 100 mol L EDTA Na2 溶液 称取 0 03721gEDTA Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml 5 20 mol L 核黄素溶液 称取 0 0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存 三 实验步骤 1 酶液提取 取一定部位的植物叶片 视需要定 去叶脉 0 5g 于预冷的研钵中 1ml 预冷的磷酸缓冲 液在冰浴上研磨成浆 加缓冲液使终体积为 5ml 取 1 5 2ml 于 1000rpm 下离心 20min 上清液即为 SOD 粗提液 2 显色反应 取 5ml 指形管 要求透明度好 4 支 2 支为测定管 另 2 支为对照管 按下列加入各溶 液 试剂 酶 用量 ml 终浓度 比色时 0 05mol L 磷酸缓冲液 1 5130mmol L Met 溶 液 0 313mmol L 750 mol L NBT 溶液 0 375 mol L 100 mol L EDTA Na2 液 0 310 mol L 20 mol L 核黄素 0 320 mol L 酶液 0 052 支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏 水 0 25 总体积 3 0 混匀后将 1 支对照管置暗处 其它各管于 4000Lx 日光下反应 20min 要 求各管受光情况一致 温度高时间缩短 低时延长 3 SOD 活性测定与计算 至反应结束后 以不照光的对照管做空白 分别测定其它各管的吸光度 四 结果计算 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50 为一个酶活性单位表示 按下式计算 SOD 活性 SOD 总活性 Ack AE V Ack 0 5 W Vt 上式中 SOD 比活力 SOD 总活性蛋白质含量式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示 比活力单位以酶单位 mg 蛋白表示 Ack 照光对照管的吸光度 AE 样品管的吸光度 V 样品 液总体积 ml Vt 测定时样品用量 ml W 样鲜重 g 蛋白质含量单位为 mg 蛋白 g 鲜重 超氧化物歧化酶 SOD 活性的测定 实验原理 SOD 是含金属辅基的酶 它催化以下反应 02 02 2H H202 02 由于超氧阴离子自由基 02 寿命短 不稳定 不易直接测定 SOD 活性 而采用 间接的方法 目前常用的方法有 3 种 包括氮蓝四唑 NBT 光化还原法 邻苯三酚自氧化法 化学发光法 本实验主要介绍光化还原法 其原理是 氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条 件下 照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙 蓝色甲腙在 560nm 处有最大光吸收 SOD 能抑制 NBT 的光化还原 其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比 试剂 1 50m mol l pH7 8 的磷酸缓冲液 PBS 含 0 1m mol l EDTA 2 220m mol l 甲硫氨酸 称 3 2824g 甲硫氨酸 用 50m mol l pH7 8 的磷酸缓冲液定溶至 100ml 现配现用 3 1 25m mol l 氯化硝基四氮唑蓝 NBT 溶液 现配 称 NBT 0 102g 用 50m mol l pH7 8 的磷酸缓冲液 PBS 溶解定容至 100ml 4 0 033m mol l 核黄素 称 2 52mg 用 PBS 溶解定容至 200ml 遮光保存 实验步骤 1 酶液制备 称取植物组织 0 5g 先加入 2 5ml PBS 研磨匀浆后 再加入 2 5ml PBS 混匀 4 下 10000r min 离心 15min 上清液即为粗酶液 取部分上清液经适当稀释后用于酶活性 测定 2 酶活性测定 取 10ml 小烧杯 7 只 3 只测定样品 4 只作为对照 按下表加入试计 试剂用量 ml 终浓度 比色时 50m mol l PBS 220m mol l Met 1 25m mol l NBT 0 033m mol l 核黄素 酶液 总体积 4 05 0 3 0 3 0 3 0 05 5 0 13m mol l 75 mol l 2 0 mol l 对照以缓冲液代替酶液 将上述试剂混匀后 1 只对照烧杯至于暗处 另 3 只对照烧杯和样品一起置于 4000lx 日光灯下反应 20min 要求各管受光一致 温度高时时间缩短 温度低时可适当延 长 最后在 560nm 处测定反应液的光密度 以不照光的对照烧杯作参比 分别测定其 他各管的光密度 3 蛋白含量的测定 步骤 1 的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G 250 法测定蛋白含量 实验结果及计算 SOD 活性单位是以抑制 NBT 光化还原的 50 为一个酶活性单位表示 可按下式计 算 SOD 活性 SOD 总活性 SOD 比活力 SOD 总活性 蛋白质总浓度 式中 SOD 总活性以 U gFW 比活力单位以 U mg 蛋白表示 ACK 为对照杯 光照 的光吸收 值 AE 为样品的光吸收值 V 为样液总体积 V1 为测定时样品用量 W 为样重 g 缩写 SOD 超氧化物歧化酶 CAT 过氧化氢酶 POD 过氧化物酶 MDA 丙 二醛 PVP 聚乙烯吡咯烷铜 K 30 L Met 甲硫氨酸 NBT 氮蓝四唑 TBA 硫代巴比妥酸 TCA 三氯乙酸 PBS 磷酸缓冲液 SOD 的测定方法 加样顺序 V 3ml 磷酸缓冲液 1 5ml L Met 0 3ml NBT 0 3ml EDTA Na2 0 3ml 核黄素 0 3ml 酶液 0 05ml 蒸馏水 0 25ml 试剂配制 1 0 05mol L PBS pH7 8 2 130mmol L L Met 1 9399g Met 用 PBS 定容至 100ml 3 750mmol L NBT 0 06133g 用 PBS 定容至 100ml 避光保存 4 100umol L EDTA Na2 0 03721g 用 PBS 定容至 1000ml 5 20umol L 核黄素 0 0753g 用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存 注 1 对照 以加缓冲液 不照光为空白 照光的为最大还原管 2 照光后至显蓝色要立即避光放置 迅速测定 A560 值 SOD 活性的测定方法 2005 10 31 12 51 00 By abingxu 0 推荐 pH7 8 最适 按邵从本等 1993 方法 1 试剂 反应液 含 13 10 3M 甲硫氨酸 MW 149 21292 75 10 6MNBT MW 817 7 2 10 6M 核黄素 MW 376 36 100 10 9MEDTA 50 10 3M 磷酸缓冲液 pH7 8 4 096225g Na2HPO4 12H2O 0 16576075g NaH2PO4 2H2O 用蒸馏水溶解 加入 0 484942g 甲硫氨酸 0 01533g NBT 0 00075272g 核黄素 扩大 10 倍 溶于 10ml 蒸馏 水 取 0 25ml 此 2 种药剂现用现加 及 0 000037224g EDTANa2 配时扩大 100 倍 用 蒸馏水定容 100ml 后 取 0 75ml 定容至 250ml 4 避光保存 2 操作 取 30 支粗细 厚薄一致的洁净试管 分别加入 3 98 反应液 29 支加 20ul 酶液 另一 支不加酶液加同样体积的提取缓冲液 以 1 支加酶的不作光照处理的为空白对照 余 4000Lux 照光 20 25 分钟后测 OD560 每提取液重复 3 次 取平均值 3 计算 在上述条件下 抑制 50 NBT 光化还原的酶量定为一个酶单位 按 Constantine N et al 1977 Pl Physiol 59 309 314 方法计算酶比活力 SOD units mg protein OD560 不加酶 OD560 加酶 1 稀释倍数 4 反应液体积 0 02 所加酶液 ml 数 每 ml 酶粗提液含蛋白 mg 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD EC 1 15 1 1 参照 Donahue 等 1997 Schickler 和 Caspi 1999 的方法 不同人工老化大豆种子的胚轴在液氮种迅速研磨程均匀 粉末 约 0 1 g 材料于 3 mL 提取缓冲溶液 50mmol L 1 Na2HPO4 NaH2PO4 缓冲液 pH 7 0 含 1 0 mmol L 1 EDTA 0 05 V V Triton X 100 2 W V 不溶性聚乙烯吡咯 烷酮 中研磨成匀浆 经过 10000 g 5min 和 16000 g 20min 4 下两次离心后 取 上清液进行 SOD 活性测定 或液氮冷却后存于 80 SOD 酶活性