二代测序简介ppt课件.ppt

第二代测序技术简介 公司理念 毅新兴业以生命科学研究为本 致力于科学技术服务 为客户提供完美的科研平台 基因组SNPs 包括芯片 massarray 第二代大规模测序病毒包装miRNA表达谱蛋白组血清多肽谱2DELC MS Shotgun法 代谢组NMRLC MS 自主仪器恒温金属浴梯度PCR仪恒温振荡仪Squenom质谱仪SAI质谱仪MALDITOF TOF测序仪 PolonatorG 007 试剂自主研发液体蛋白磁珠SBI试剂慢病毒RNA干扰库MicroRNA研究干细胞研究 3 内容提纲 从Sanger法到新一代测序技术第二代测序平台介绍第二代测序技术应用宏基因组学 Metagenomics 泛基因组学 Pangenomics KeyGenomicsTechnologies 1975 SouthernDNAhybridizationtechnique1977 Sanger schain terminationandMaxam Gilbert schemicalDNAsequencingmethods1980 Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985 Mullis sdiscoveryofPCRatCetus1992 Affymatrix Fodor sgroup firstgene chip1995 ABI sfirstautomatedDNAsequencer2006 2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyond Singlemoleculesequencingtechniques Sanger sMethod Labeledprimer 1 Sequencereactions 4 Sequenceseparations 4 Sequenceread out 1st GenerationAutomatedDNASequencer Parallelrunson96capillariesonABI3700 Limitationof1stGenSequencer ThroughputTime consumingseparationofchain terminatedfragmentsHardtoproducemassivelyparallelsystembasedelectrophoreticseparationSequencingCostSamplehandlingDifficulttominiaturize NeedforFasterandCheaperSequencingTechnology PersonalGenomeProject TrendsinNext GenerationSequencing Large scaleandhigh throughputAmplificationonsolidsurfaceClustergeneration bridgeorpolonyamplification EmulsionPCR fragmentonbeads InsitusequencingbychainextensionSequencebysynthesis DNApolymeraseSequencebyligation DNAligaseMassivelyparallelprocessingArrayofclusters beadsMiniaturizationthroughmicrofluidicSinglemoleculedetection 测序技术目标 陈竺 日本血吸虫基因组 人类全基因组测序的目标 1000美元 人2008年预测5年内实现 2006年底 美国X大奖基金会设立了基因组ArchonX大奖 奖金高达1000万美元 这项大奖将颁给第一个能在10天之内 用不到100万美元的费用 完成100个人类基因组测序的团队 附加条件是覆盖率不小于98 误差不大于1 100000bp Next GenPlatforms GA Illumina SolexaSBSwithreversiblefluorescentterminatorsGSFLX Roche 454LifeSciencesSBSthroughpyrosequencingSOLiD ABI AgencourtSBLwithdualbaseencodingPOLONATOR DanaherMotionSBLwithbaseencoding Next GenSequencingWorkflow FragmentLibraryPreparationRandomPair end 2ndGenerationPerformance Roche 454LifeSciences GenomeSequencer Roche 454Workflow DNALibraryPrepDNAFragmentEndrepairedAsymetricAdaptorsligated onebiotinylated ImmobilizedonstreptavidincoatedmagneticbeadsDenatured sstemplateDNAlibraryPurified EmulsionAmplificationTemplateDNAimmobilizedonprimercoatedcapturebeadsthruhybridization 1fragmentoneachbead Thermocyletoamplify forwardprimerisbiotinylated Amplifiedbeadsenrichedwithstreptavidincoatedmagneticbeads Roche 454Workflow BeadDepositionOneamplifiedbeadpermicrowellFollowedbyenzymebeadsandpackingbeadsEnzymebeadsSulfurylaseLuciferasePackingbeadshelptokeepDNAbeadinmicrowell Pyrosequencing4nucleotidessequentiallyflowinIncorporationofanucleotidereleasesapyrophosphate PPi SufurylaseconvertPPiintoATPATPhydrolizedbyluciferaseusingluciferintoproducelight Pyrosequencing ConvertPPitoATP UseATPtogeneratelight Remove d NTPsandexcessATP Roche 454Workflow ImageAcquisitionByCCDcameracoupledtothepicotiterplateChemiluminescentintensityreflectsnumberofnucleotideincorporatedineachflow usedtodeterminehomopolymerregionUpto100cyclesrepeated Post acqProcessingDenovosequencingResequencingAmpliconvariantanalysis ImageProcessingChemiluminescenteventmapedtowellFlowgramgeneratedforeachwellBasecalled Roche 454LifeSciences GenomeSequencer 速度快 一个测序反应耗时10个小时 获得100余万个读长和4 6亿个碱基对 测序读长最长 单个序列的读长更长 平均可达到400 500个碱基左右 准确度高 读长超过400bp时 单一读长的准确性可以超过99 一致性好 测序结果一致性超过99 99 可以进行Pair End测序研究 功能强大的基因组分析工具 PolonatorG 007 Polonator系统是由Dr GeorgeChurch和他的研究小组发明 该系统使用了美国最先进试剂处理和检测的部件 采用了最敏感的检测设备 现在已发展成为一个包含多个基因组学应用领域的研究平台 并且承担了美国 PersonalGenomeProject 的个人基因组测序任务 PolonatorG 007最大的优势在于开机运行成本低和Linux开放资源软件 PolonatorG 007Workflow 配对末端文库制备 配对末端文库是将基因组DNA打断后 与中间接头连接 再环化 然后用Mme1酶切 使中间接头两端各有 30bp的碱基 再加上两端的接头 形成文库 乳液PCR 在微反应器中加入测序模板 PCR反应元件 微珠和引物 进行乳液PCR EmulsionPCR 微球富集和固定 PCR完成之后 变性模板 富集带有延伸模板的微珠 去除多余的微珠 将微珠沉积在一块玻片上 微珠上的模板经过3 修饰 可以与玻片共价结合 连接反应测序 polonator连接反应的底物是9碱基单链荧光探针混合物 探针的5 末端分别标记了CY5 TexasRed CY3 6 FAM这4种颜色的荧光染料 连接反应中 这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对 结合的探针就提供了一个荧光检测信号 最终被仪器识别 PolonatorG 007 数据量 每次运行可以得到 10Gb的高质量数据运行时间 80小时读长 30bp 2 每次运行可以读取1 2 1 3 109个磁珠准确性 超过99 运行成本 仅为目前二代测序系统运行成本的60 样品数 运行 同时支持2 8道最多16个样品测序 Illumina Solexa GenomeAnalyzer IlluminaGenomeAnalyzer是一种基于单分子簇的边合成边测序技术 它基于专有的可逆终止化学反应原理 Illumina SolexaWorkflow SolexaGenomeAnalyzer 测序通量高 每次运行后可获得30GB的高品质过滤数据 简单 快速 自动化 制备样品文库可以在几小时内完成 一个星期内就能得到高精确度的数据 DNA序列的读取长度不断增加 当前达到100bp 单个或配对末端支持 GenomeAnalyzer系统支持单个片段或配对末端文库 每张芯片有8个通道 每个通道可单独测序一个样品 也可以把多个样品混合在一起测序 ABISOLiD LibraryPrep Shearedfragmentsaretaggedwithadapters A1andA2 toeachend ABISOLiD EmulsionPCR EmulsionPCRperformedusingDNAfragmentsfromlibraryonbeads m coatdwithoneoftheprimers ABISOLiD BeadDeposition AmplifiedbeadenrichedonpolystyrenebeadscoatedwithA2adaptor anybeadcontainingtheextendedproductswillbindpolystyrenebeadthroughitsP2end ThisincreasethethroughputofbeadswithtargetedDNAfrom30 to80 3 endofenrichedproductmodifiedtoallowcovalentattachementtoglassslidesurfacerandomly FluorescentProbes ABISOLiD SequencebyLigation Usedualbaseencodingthrough8 merprobeswithaligationsiteatthe3 end afluorescentdyeatthe5 end andacleavagesitebetweenthefifthandsixthnucleotideEachcolorrepresentstwonucleotidesinwhichthesecondbaseofeachdinucleotideunitconstitutesthefirstbaseofthefollowingdinucleotide knowingjustonebaseinthesequencewillleadustointerpretthewholesequence Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 35 Genomesequencingprojectsstatistics Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 人类基因组计划 HumanGenomeProject 1000GenomesProject PersonalGenomeProject CancerGenomeProject Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 转录组测序 外显子测序 转录本结构研究 UTR鉴定 Intron边界鉴定 可变剪切研究等 非编码区域功能研究 non codingRNA研究 microRNA前体研究等 基因转录水平研究全新转录区域研究 千种植物转录组研究计划 Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 小分子RNA测序分析 新miRNA分子的挖掘 其作用靶基因的预测和鉴定样品间差异表达分析miRNAs聚类和表达谱分析等 SmallRNA microRNAs siRNAs和piRNAs 是生命活动重要的调控因子 在基因表达调控 生物个体发育 代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用 Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 Metagenomics 宏基因组学 也称元基因组学 环境基因组学 生态基因组学 是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象 以测序分析和功能基因筛选为研究手段 研究微生物多样性 种群结构 进化关系 功能活性 相互协作关系及与环境之间关系的新方法 对特定环境微生物种群全基因组DNA研究 可以从整体上对样品群落进行分析 不受微生物是否能培养的限制 而且研究对象从单一基因组到一个基因组集合 也摆脱了对于传统基因组研究的物种限制 开辟了微生物群体基因组学研究的新路径 Next GenResearchApplications denovo测序全基因组重测序 基因组结构变异转录组测序 外显子测序小分子RNA测序分析宏基因组学 Meta Genomics 泛基因组学 Pangenome DNA甲基化分析ChIP测序 Pangenome Pangenome whole supra genome isthetotalgenerepertoireinagivenspecies including coregenome whichissharedbyallindividuals dispensablegenome whichisshare