总结-酵母酶活测定

2 9 3 Galactosidase 酶活定量实验酶活定量实验 参考参考 Clontech Yeast Protocols Handbook 进行进行 酵母酶活测定 酵母酶活测定 准备 每个样品 准备 每个样品 8 ml 的的 YPD 培养基 培养基 Y190 菌株 转化用 菌株 转化用 Z buffer Z buffer beta 巯基乙醇 巯基乙醇 Z buffer ONPG NA2CO3 1 准备准备 5 ml SD Leu Trp 液体培养基过夜培养的酵母菌 同时将液体培养基过夜培养的酵母菌 同时将 ONPG 溶解在溶解在 Z 缓冲液中 缓冲液中 4 mg ml 调 调 pH 7 0 并振荡混匀 并振荡混匀 1 2 hr 2 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡 0 5 1 min 立刻取出 立刻取出 2 ml 加入加入 8 ml 的的 YPDA 中 中 3 30 250 rpm 摇摇 3 5 hr 测 测 OD600在在 0 5 0 8 之间并记录确切之间并记录确切 OD 值 值 4 取取 3 个个 1 5 ml 的的 EP 分别倒入分别倒入 1 5 ml 菌液 菌液 14 000 rpm 离心离心 30 sec 小心弃上清 加入小心弃上清 加入 1 5 ml Z 缓冲液 振荡以重悬菌体 缓冲液 振荡以重悬菌体 5 离心去上清 加入离心去上清 加入 300 l Z 缓冲液重悬菌体 则浓缩倍数为缓冲液重悬菌体 则浓缩倍数为 1 5 0 3 5 倍 倍 6 取取 0 1 ml 至新管中 液氮冷冻至新管中 液氮冷冻 0 5 1 min 37 0 5 1 min 使其融化 使其融化 7 反复冻融反复冻融 3 次以上使细胞尽可能破碎 次以上使细胞尽可能破碎 8 取一个新管加入取一个新管加入 100 l Z 缓冲液作为空白对照 缓冲液作为空白对照 9 每管中加入每管中加入 0 7 ml Z 缓冲液缓冲液 巯基乙醇 加入巯基乙醇 加入 160160 l 溶在溶在 Z 缓冲液缓冲液 中的中的 ONPG 同时开始计时 将管置于同时开始计时 将管置于 30 温浴 温浴 10 当溶液变为黄色时 加入当溶液变为黄色时 加入 0 4 ml Na2CO3中止反应 计录反应时间中止反应 计录反应时间 t 11 14 000 rpm 离心离心 10 min 取上清 测 取上清 测 OD420值 值 12 计算计算 Galactosidase 酶活 酶活 Galactosidase units 1 000 OD420 t V OD600 t 为反应时间 第为反应时间 第 10 步记录 步记录 V 为为 0 1 浓缩倍数 第浓缩倍数 第 5 步记录 步记录 OD600为第为第 3 步所测步所测 OD 值值 2 9 4 提取酵母蛋白提取酵母蛋白 参考参考 Clontech Yeast Protocols Handbook 进行 进行 1 接酵母菌于接酵母菌于 SD Leu Trp 培养基中 培养基中 30 摇培过夜 摇培过夜 2 扩培至扩培至 50 ml YPDA 培养基中 培养基中 30 摇培至摇培至 OD600为为 0 4 0 6 计算总 计算总 OD600值 测得的值 测得的 OD600值值 培养液体积 培养液体积 3 将菌倒入预冷的离心管中 将菌倒入预冷的离心管中 4 1000 g 5 min 弃上清 细 弃上清 细 胞重悬于胞重悬于 50 ml 预冷的超纯水中 预冷的超纯水中 4 4 1000 g 5 min 弃上清 冷的超纯水再洗一次 沉淀冻 弃上清 冷的超纯水再洗一次 沉淀冻 到液氮中 继续下面的实验或冻存于到液氮中 继续下面的实验或冻存于 80 5 每每 7 5 OD600加入加入 100 l 60 预热的裂解缓冲液 用前加入预热的裂解缓冲液 用前加入 PMSF 和和 cocktail 因 因 PMSF 有半衰期 需每隔有半衰期 需每隔 7 min 补一次 补一次 60 水浴小于水浴小于 2 min 使菌体融化并重悬起来 使菌体融化并重悬起来 6 转移到转移到 1 5 ml 的的 EP 管中 加入适量管中 加入适量 glass beads 80 l 7 5 OD600 70 10 min 剧烈振荡 剧烈振荡 1 min 7 4 14 000 rpm 离心离心 5 min 将上清转移至新的 将上清转移至新的 EP 管中并置管中并置 于冰上 于冰上 8 沉淀置于沉淀置于 100 3 5 min 剧烈振荡 剧烈振荡 1 min 4 14 000 rpm 离离 心心 5 min 小心吸取上清 并将两次的上清合到一起 小心吸取上清 并将两次的上清合到一起 9 100 10 min 煮样 即可进行煮样 即可进行 western blot 试剂配置试剂配置 YPDA 培养基 培养基 1 L 配方 配方 20 g Difo peptone 10 g Yeast extract 15 ml 0 2 adenine hemisulfate solution 加水至 加水至 950 ml 灭菌后冷却至灭菌后冷却至 55 再加入再加入 50 ml 40 的葡萄糖 葡萄糖溶液可的葡萄糖 葡萄糖溶液可 112 灭菌或抽滤灭菌 灭菌或抽滤灭菌 若为固体培养基灭菌前还需加 若为固体培养基灭菌前还需加 20 g L Agar SD Leu Trp 培养基 培养基 6 7 g L Yeast nitrogen without amino acids 0 67 g L Leu Trp DO supplement 若为固体培养基需加 若为固体培养基需加 20 g L Agar 灭菌 灭菌 SD Ade His Leu Trp 培养基 培养基 6 7 g L Yeast nitrogen without amino acids 0 6 g L Ade His Leu Trp DO supplement 若为固 若为固 体培养基需加体培养基需加 20 g L Agar 灭菌 灭菌 贮存液 贮存液 10 TE 0 1 M Tris HCl 10 mM EDTA 调 调 pH 7 5 灭菌 灭菌 10 LiAc 1 M LiAc 乙酸调 乙酸调 pH 7 5 灭菌 灭菌 50 PEG4000 PEG LiAc 40 PEG 1 TE 1 LiAc Z 缓冲液 缓冲液 16 1 g L Na2HPO4 7H2O 5 5 g L NaH2PO4 H2O 0 75 g L KCl 0 246 g L MgSO4 7H2O 调 调 pH 7 0 并灭菌 并灭菌 Z 缓冲液缓冲液 巯基乙醇 巯基乙醇 100 ml Z 缓冲液加入缓冲液加入 0 27 ml 巯基乙巯基乙 醇 醇 裂解缓冲液 储存液 裂解缓冲液 储存液 8 M 尿素 尿素 5 SDS 40 mM Tris HCl pH6 8 0 1 mM EDTA 0 4 mg ml 溴酚兰 使用前每毫升储溴酚兰 使用前每毫升储 存液加入存液加入 10 l 巯基乙醇 并加蛋白酶抑制剂巯基乙醇 并加蛋白酶抑制剂 PMSF 和和 cocktail 2 10 酵母互补实验酵母互补实验 所用的载体为所用的载体为 Dr Hiten D Madhani 实验室实验室 University of California 惠赠的惠赠的 p415 ADH1 改造改造 用 用 ADH1 启动子驱动或启动子驱动或将将 ADH1 启动子换为酵母启动子换为酵母 BRE1 启动子 分别连接拟南芥的启动子 分别连接拟南芥的 HUB1 和和 HUB2 基因 构建好的质粒转化酵母基因 构建好的质粒转化酵母 bre1 YM1740 空载体转 空载体转 化野生型化野生型 YM1736 S288C 及 及 bre1 YM1740 作为对照 统计 作为对照 统计 细胞体积大小参照细胞体积大小参照 Hwang et al 2003 进行 大体流程如下 进行 大体流程如下 1 将酵母菌接于将酵母菌接于 SD Leu 培养基中 培养基中 30 摇培至摇培至 OD600 0 6 0 8 2 加入加入 2 甲醛 甲醛 30 20 min 固定 固定 3 离心收集菌体 用离心收集菌体 用 0 1 M 的磷酸钾 的磷酸钾 pH6 5 洗 洗