常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制

常见猪病常见猪病 PCRPCR 检测操作步骤及试剂配制检测操作步骤及试剂配制 一 RNARNA 病毒病毒 蓝耳病 猪瘟 乙脑 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻 病毒 轮状病毒等 包括病料的处理 RNA 的提取 反转录 和 PCR 扩增 凝胶电泳四个步骤 1 1 病料的处理病料的处理 取组织病料约 2 克 加入 4 5 毫升灭菌的 PBS 或者生理盐水 置研磨器 灭菌 中研磨或者用剪刀细心剪碎 置 20 中反复冻融三次 即可用于检测 2 2 RNARNA 的提取的提取 1 取上述冻融三次的病料约 200 微升置 1 5 毫升的离心管中 加入 500 600 微升 TRIzol 剧烈振摇 30 秒后 静置 5 分钟后 再次剧烈振摇 30 秒后 静 置 5 分钟 2 在加入 200 微升的氯仿 上下颠倒混匀 30s 静置 5 分钟 4 12000g 离心 15 min 离心完毕后 取上清约 400 500 微升 注意不要吸到中间层白色物质 置新的 灭菌好的离心管中 加入等体积的异丙醇 颠倒数次后 不可剧烈震动 静置 10 分钟 4 12000g 离心 10 min 可见管底部有少量白色沉淀 倒掉异丙醇 加入 1 毫升 75 的乙醇 DEPC 水配制 振摇 将白色沉淀悬浮 4 7500g 离心 5 min 弃去上清 干燥沉淀物 将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸 上 室温约 5 min 即可 加入 20 LDEPC 水溶解用于 RT PCR 或于 20 保存 备用 两步法 两步法 1 1 反转录 反转录 在 10 L 的反转录体系中加入 上述步骤中提取的 RNA7 L 5 Buffer 2 L 10 mM dNTP 0 25 L Oligo dT 18 0 5 L 或者下游引物 0 5 L 65 10 分钟 迅速放置 20 摄氏度冰箱中 2 分钟 加入 M MLV 100U L 0 25 L 反转录酶 37 水浴 1h 即可做为 PCR 扩增的模板 立即 用于 PCR 扩增或置于 20 保存备用 2 2 PCRPCR 扩增扩增 设立阳性和阴性对照 阳性对照一般为病毒液 阴性对照用灭菌的双蒸水做为 PCR 反应模板 反应总体系为 25 L cDNA 2 L 模板 25mmol L Mg2 1 5 L 2 5mmol L dNTPs 2 0 L 10 Mg2 free PCR Buffer 2 5 L 20mmol L 上下游引物各 1 L Taq DNA 聚合酶 5U L 0 2 L 无菌双蒸水补至 25 0 L PCR反应条件为 94 预变性3 min 94 45s 56 45s 72 45s 共进行 36个循环 最后72 延伸10min 根据不同的病毒设定时间和温度 一步法 采用的是一步法 采用的是TaKaRaTaKaRa 的的PrimeScriptPrimeScript OneOne StepStep RT PCRRT PCR KitKit Ver 2Ver 2试剂盒试剂盒 在在25uL25uL反应总体系 反应总体系 PrimeScriptPrimeScript 1 1 StepStep EnzymeEnzyme MixMix 1uL1uL 2 2 1 1 StepStep BufferBuffer 12 5uL12 5uL RNaseRNase FreeFree dHdH2 2O O 6 5ul 6 5ul 20mmol 20mmol L L 上下游引物各上下游引物各 1 L1 L 提取的提取的RNARNA模板 模板 3ul3ul 反应条件 反应条件 5050 反转录30min 94 预变性2min 进行30个循环 94 变性 1min 56 退火1min 72 延伸1min 最后72 延伸10min 扩增完的PCR产物 放4 保存 3 3 凝胶电泳凝胶电泳 1 琼脂糖凝胶的配制 0 25琼脂糖 25毫升TAE 1 25微升Goidview放入锥形瓶中 置烤箱中约1分钟沸 腾后 摇匀 放置室外 约20 30分钟后倒入板中 约30 45分钟凝固后即可使 用 点样 将凝胶放入电泳槽中 DL2000的DNA Marker3 5微升 其它样品5微升 0 5 1微升的londingbuffer混合后点样 开启电泳仪 电压80 150V 4 4 PCRPCR 产物回收纯化产物回收纯化 取20 L PCR产物与4 L 6 Loading Buffer混匀 1 琼脂糖凝胶 GoldView 0 5ug ml 电泳 电泳结束后 在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶 用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液 此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多 余凝胶以减小凝胶体积 从而提高DNA的回收产率 之后按照胶回收试剂盒产品 说明书回收目的片段 并取1 L回收产物点样观察回收效果 纯化步骤如下 1 称量胶块重量 计算胶块体积 按照 1mg 等于 1 L 计算胶块体积 2 向胶块中加入 3 倍胶块体积的融化液 DR I Buffer 3 均匀混合后 65 水浴 10 min 其间摇晃 3 5 次使胶块完全溶化 4 向上述胶块融化液中加入 DR I Buffer 0 5 倍体积量的 DR II Buffer 均 匀混合 5 转移液体至 Spin column 中 12 000 rpm 离心 1min 弃滤液 可将滤出 液体回收再离心一次以提高 DNA 回收率 6 将 500ul 的 RinseA 加入 Spin column 中 12 000 rpm 离心 30s 弃滤液 7 将 700 ul 的 Rinse B 加入 Spin column 中 静置 2 3 min 12 000 rpm 离心 30s 弃滤液 8 重复上一步操作 9 10 000 rpm 离心 1min 弃滤液 10 将 Spin column 安置于一灭菌的 1 5ml Eppendorf 管中 在滤膜中央处 加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液 20 30 微升 室温静置 1 2 min 11 12 000 rpm 离心 1min 收集滤出液体再离心洗脱一次 即得到纯化的 PCR 产物 注 PCR 纯化产物可直接用于测序 如用 PCR 回收产物直接测序时 回收第 10 步中不可用洗脱缓冲液 只可用双蒸水 5 DNADNA 病毒病毒 PCV2 伪狂犬病毒 细小病毒等 包括病料处理 DNA 的提取和 PCR 扩增 凝胶电泳四个步骤 1 1 病料处理同上病料处理同上 2 2 DNADNA 的提取的提取 1 取处理好的病料约 1 毫升置 1 5 毫升的离心管中 12000 rpm min 离心五分 钟 取上清液 500 700 l 缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止 5 分钟 12000 rpm 离心 10 分钟 2 2 去上清至新的离心管中 加入终浓度为分别为 10 的 SDS 约 50 微升 和 50 g ml 蛋白酶 K 约 10 微升 55 作用 1 5h 2h 提前准备好水浴锅 提前准备好水浴锅 3 加入 200uL Tris 饱和酚 振荡混匀 4 12000 rpm min 离心 15min 4 取上清液 于一个新的离心管中 加入 Tris 饱和酚和氯仿各 200uL 充分 混匀 12000 rpm min 离心 15min 5 取上清于一新的离心管中 加入 200uL 氯仿 充分混匀 12000 rpm min 离 心 15min 6 去上清于新的离心管中 加入 2 倍体积无水乙醇 20 放置 20min 12000 rpm min 离心 15min 弃上清 无水乙醇提前冰浴无水乙醇提前冰浴 7 加入 70 的乙醇 提前放入冰箱 提前放入冰箱 冲洗沉淀表面和管壁 弃乙醇 晾干 若无沉淀可以离心 7500 rpm min 离心 5min 8 最后加入 20 l 无菌 ddH2O 溶解 20 保存备用 3 3 PCRPCR 扩增扩增 设立阳性和阴性对照 阳性对照一般为病毒液 阴性对照用灭菌的双蒸水做为 PCR 反应模板 反应总体系为 25 L cDNA 2 L 模板 25mmol L Mg2 1 5 L 2 5mmol L dNTPs 2 0 L 10 Mg2 free PCR Buffer 2 5 L 20mmol L 上下游引物各 1 L Taq DNA 聚合酶 5U L 0 2 L 无菌双蒸水补至 25 0 L PCR反应条件为 94 预变性3 min 94 45s 56 45s 72 45s 共进行 36个循环 最后72 延伸10min 根据不同的病毒设定时间和温度 3 3 凝胶电泳同上凝胶电泳同上 4 4 PCRPCR 产物的纯化回收以及测序同上 产物的纯化回收以及测序同上 试剂配制试剂配制 1 1 DEPCDEPC 水的配制水的配制 向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水 然后加入向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水 然后加入 DEPCDEPC 至终浓度为至终浓度为 0 01 0 01 V VV V 过夜 过夜 搅拌 放置摇床中 搅拌 放置摇床中 高压灭菌即可 高压灭菌即可 2 2 病料处理用 病料处理用 PBSPBS 的配制的配制 NaCl NaCl 8 00g8 00g KCl KCl 0 20g0 20g NaNa2 2HPOHPO4 4 1 421 42 g g KHKH2 2POPO4 4 0 27g 0 27g 向烧杯中加入向烧杯中加入 800800 毫升去离子水 充分搅拌 用浓盐酸调节毫升去离子水 充分搅拌 用浓盐酸调节 PHPH 至至 7 47 4 加入去 加入去 离子水定容至离子水定容至 1 1 升 高压灭菌后即可使用 升 高压灭菌后即可使用 1 1 TAETAE 电泳液电泳液 1 50 TAE1 50 TAE 贮存液贮存液 Tris242gTris242g 冰乙酸冰乙酸 28 528 5 mlml 和和 NaNa2 2EDTA 2HEDTA 2H2 2O O 37 237 2 混合混合 向 向 烧杯中加入烧杯中加入 800800 毫升去离子水 充分搅拌 加入毫升去离子水 充分搅拌 加入 57 157 1 毫升醋酸 充分搅拌 加毫升醋酸 充分搅拌 加 入去离子水定容至入去离子水定容至 1 1 升 室温保存 升 室温保存 2 1 TAE 2 1 TAE 工作液工作液 50 TAE50 TAE 贮存液贮存液 2020 mlml 加纯水定容至加纯水定容至 10001000 mlml 4 4 10 SDS10 SDS 10gSDS10gSDS 置于置于 100 200ml100 200ml 烧杯中 加入烧杯中 加入 80ml80ml 的去离子水 的去离子水 68 68 溶解 溶解 调调 PH7 2 PH7 2 早定容早定容 100ml 100ml 5 5 dNTPdNTP MixtureMixture ExTaqDNAExTaqDNA聚合酶 聚合酶 TRIZOLTRIZOL等试剂均购自等试剂均购自InvitrogenInvitrogen公司公司 M M MLVMLV购自购自PromegaPromega公司 公司 DL2000DL2000的的DNADNA MarkerMarker 一步法的一步法的PrimeScriptPrimeScript OneOne StepStep RT PCRRT PCR KitKit Ver 2Ver 2试剂盒试剂盒 购自购自 TaKaRaTaKaRa 公司 公司 TrisTris 饱和酚 购自饱和酚 购自 SolarbioSolarbio 检测用的引物 检测用的引物 1 1 蓝耳 蓝耳 上游 上游 JN1JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3 下游 下游 JN2JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3 退火温度 53 56 检测缺失毒株用检测缺失毒株用 2 2 猪瘟猪瘟 检测疫苗毒用检测疫苗毒用 上游 上游 HCV1HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3 下游 HCV2HCV2 GATTCAACTCCATGTGCCATG 退火温度 56 检测野毒检测野毒 上游 上游 CSFV1 5 ACCTAATCTTACACTATGCAATC 3 下游 下游 CSFV2 5 CTGGACTAGTCCCATCAAAT 3 退火温度 51 54 3 3 传染性胃肠炎传染性胃肠炎 上游 上游 TGEV1 5 GATGGCGACCAGATAGAAGT 3 下游 下游 TGEV2 5 GCAATAGGGTTGCTTGTACC 3 退火温度 51 4 4 流行性腹泻流行性腹泻 上游 上游 PEDV1 5 GAAATAACCAGGGTCGTGGA 3 下游 下游 PEDV2 5 GCTCACGAACAGCCACATTA 3 退火温度 51 5 乙脑 上游 上游 JE 1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3 下游 下游 JE 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3 退火温度 55 6 6