酶活力的测定

实验 26 过氧化氢酶活力的测定 必修 目的与原理目的与原理 掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法 并用此方法测定水产动物血清中过 氧化氢酶的活力 血清中的过氧化氢酶 CAT 分解 H2O2的反应 可通过加入钼酸铵而迅速中止 剩余 的 H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物 在 405nm 处测定其生成量 即可计算出 CAT 的活力 CAT 活力单位定义为 每 1 分钟分解 1 mol 的过氧化氢即为 1 个酶活力单位 U 试剂与器材试剂与器材 试剂 1 磷酸盐缓冲液 67mmol l pH 7 4 取 Na2HP04 7 60g KH2P041 82g 溶于 1L 蒸馏水中 调 pH 至 7 4 2 基质液 65 mol l H2O2 取 30 H2O2 3 69 ml 加 pH7 4 磷酸盐缓冲液至 500ml 3 钼酸铵 称取 NH4 6Mo7O24 20 2g 溶于 500ml 蒸馏水中 器材 721 分光光度计 0 5cm 比色杯 恒温水箱 37 0 5 试管 16mm 100mm 移液 管 吸耳球 可调微量进样器 实验步骤实验步骤 1 样品测定 基质液置于 37 水浴 5 min 然后按下列步骤操作 试剂对照管标准管测定管 基质液 1 0ml1 0ml1 0ml 钼酸铵1 0ml1 0ml 缓冲液 0 2ml 血清0 2ml 0 2ml 37 水浴准确温育 60s 后 立即加入钼酸铵 1 0ml 摇匀 10min 后于 405nm 以蒸馏水 调零比色 记录各管吸光度值 A 2 计算 过氧化氢酶活力 U L A对 A测 A标 65 1 1000 0 2 1000 A对 A测 A标 325 式中 65 为标准管 H2O2浓度 1 为 1 0ml H2O2体积 1000 换算成 1L 血清 0 2 为血清用 量 1000 为 mol 换算成 mmol 方法评估方法评估 本实验采用分光光度法测定底物 H2O2 的减少量来评价过氧化氢酶活力 此法操作 简便 准确 在实验时间 1 小时 内显色稳定 适于科研和实验检验用 应用意义应用意义 CAT 具有重要的生理功能 细胞内与产生 H2O2的需氧脱氢酶类 如氨基酸氧化酶等 同时存在 能将细胞代谢所产生的毒性物质 H2O2迅速加以清除 从而共同保护血红蛋白 巯基酶 膜蛋白和解毒作用 此外 CAT 清除 H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的 毒害 因而有抗衰老和保护作用 注意事项注意事项 1 反应时间在 80 秒内吸光度降低与反应时间成反比关系 故选用 60 秒为测定时间 所以本法不宜大批量样品同时测定 以每批 4 5 份为宜 2 酶活力在 100 140U 范围内呈线性关系 钼酸铵和 H2O2呈色反应在 pH 7 时吸光 度升高 当 pH 7 6 时吸光度下降 故选用 pH7 4 作为测定条件 3 黄色复合物至少在 1h 内稳定 4 血清不能溶血 溶血样品应该弃去 5 加入钼酸铵后 由于释放 O2 气泡会干扰比色 宜在显色 10min 后比色 思考题思考题 1 试述过氧化氢酶的测定方法 2 底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为 60 秒 3 试述过氧化氢酶催化 H2O2反应的机制 淀粉酶活力的测定 必修 目的与原理目的与原理 掌握淀粉酶活力的测定方法 测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏 胃 肠内的 淀粉酶活力 淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解 产生葡萄糖 麦芽糖等 在基质充分的条件 下 反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物 其蓝色深浅与未经酶促反应 的空白管比较其吸光度 从而推算出淀粉酶的活力单位 试剂与器材试剂与器材 试剂 1 0 04 可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉 0 20g 置于 20ml 烧杯内 加入蒸馏水约 5ml 摇匀使成淀粉混 悬液 另称取无水磷酸二氢钠 13 3g 及苯甲酸 4 3g 共置于 500ml 烧杯内 加入蒸馏水约 250ml 煮沸后 将淀粉混悬液倒入此烧杯内 并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次 洗涤亦倒入此烧杯内 继续煮沸 1 分钟 冷却至室温后倒入 500ml 容量瓶中 并用蒸馏水 稀释至 500ml 刻度 此淀粉液 pH 应为 7 0 0 1 在室温下保存 2 3 个月 2 0 1N 碘贮存液 精确称取碘酸钾 KIO3 3 567g 及碘化钾 KI 45g 置于 1L 容量瓶 内 加入蒸馏水约 800ml 然后缓慢加入浓盐酸 9ml 摇匀后用蒸馏水稀释至 1L 刻度 置 冰箱内备用 3 0 01N 碘应用液 取 0 1N 碘贮存液 50ml 用蒸馏水稀释至 500ml 盛于棕色瓶中 置冰箱内约保存 1 个月 材料 新鲜鱼 虾 贝的肝胰脏 胃 肠标本 器材 分光光度计 电子天平 离心机 pH 测定仪 恒温水箱 匀浆器 剪子 镊子 冰块 50ml 比色管若干 移液管若干 500ml 容量瓶 烧杯 实验步骤实验步骤 1 酶提取液的制备 取新鲜肝胰脏 胃 肠组织称重 在冰盘上剔除脂肪及内容物 以 10 倍缓冲液或去离 子水匀浆各组织 将组织悬液低温下离心 3000rpm min 上清液为酶粗提液 酶液 2 见实验蛋白酶活力的测定 2 淀粉酶活力的测定 取 50ml 刻度比色管二只 标明为对照管 测定管 对照管测定管 0 04 可溶性淀粉5 0ml5 0ml 将两管在 37 水浴中预热 2 5 分钟 酶液 0 1ml 测定管混匀后 再置 37 水浴中反应 7 5 分钟 0 01N 碘应用液5 0ml5 0ml 用蒸馏水稀释至 50ml 立即混匀 用 660nm 或红色滤光板进行比色 以蒸馏水校正 光密度 0 点 读取对照管和测定管光密度读数 3 计算 淀粉酶活力单位定义 在 370C 30min 内 100ml 酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉 10mg 称为一个淀粉酶活力单位 淀粉酶活力单位 100ml 对照管光密度 测定管光密度 对照管光密度 2 10 30 7 5 100 0 1 对照管光密度 测定管光密度 对照管光密度 800 方法评估方法评估 测定淀粉酶的方法有很多种 大致可分为两类 即测定底物 淀粉 的减少量和测定 产物 如还原性糖 的生成量 本实验采用前者的淀粉 碘比色法 应用意义应用意义 分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力 由于鱼虾等水产动 物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同 以及动物所处生活环境的变化 各种水产 动物对食物的消化吸收有明显的差别 认识鱼虾消化酶变化特性 为研究水产种类饲料配 伍提供科学依据 注意事项注意事项 1 0 04 可溶性淀粉溶液 5ml 内含淀粉量为 2mg 在本法条件下 当 2mg 淀粉完全水 解时相当于 800 淀粉酶单位 100ml 即 2 10 30 7 5 100 0 1 800 2 对照管内含淀粉 2mg 由于淀粉溶液比较稳定 故对照管在固定比色计上的光密度 读数并不改变 因而在测定中不必每次作对照管 3 当淀粉酶接近 800 单位时 由于淀粉已几乎完全被水解 故加入碘液后也不再显蓝 色 因此淀粉酶单位较高时 接近 60