双水相萃取实验

一 双水相系统的相图绘制一 双水相系统的相图绘制 1 实验目的 了解制作双水相系统的相图的方法 加深对相图的认识 2 实验原理 相图是研究两水相萃取的基础 双水相形成条件和定量关系常用相图来表 示 图 1 是典型的高聚物 高聚物 水双水相体系的直角坐标相图 两种聚合物 A B 以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成 度的两相 上相组成用 T 点 表示 下相组成用 B 点表示 由图 1 可知上下相所含高聚物有所偏重 上相主 要含 B 下相主要含 A 曲线 TCB 称为结线 直线 TMB 称为系线 结线上方是两 相区 下方为单相区 若配比取在曲线上 则混合后 溶液恰好从澄清变为混 浊 组成在系线上的点 分为两相后 其上下相组成分别为 T 和 B T B 量的 多少服从相图的杠杆定律 即 T 和 B 相质量之比等于系线上 MB 与 MT 的线段长 度之比 又由于两相密度相差很小 故上下相体积之比也近似等于系线上 MB 与 MT 线段长度之比 图 1 A B 水双水相体系相图 Figure 1 The phase diagram of the A B H2O aqueous two phase system 3 实验器材和试剂 1 器材 电子台秤 漩涡混合器 大试管 滴定管 密度计 温度计 2 试剂 聚乙二醇 硫酸铵 硫酸镁 4 操作方法 1 溶液的配制 配制40 的盐 硫酸铵或硫酸镁 溶液 配制40 的聚乙二醇溶液 液体聚乙二醇可用纯溶液 2 相图的制作 精确称取一定质量 0 7000g左右 PEG溶液于大试管中 按表1所列第1列 数据 加入0 5mL去离子水 用滴定管缓慢滴加已配好的40 的盐溶液 并不断 在漩涡混合器上混合 观察溶液的澄清程度 直至试管内液体出现浑浊为止 记录盐溶液的加量 g 然后 按表格所列第2列数据加入水 溶液澄清 继续 向试管中滴加盐溶液并不断混匀 直至再次达到浑浊 如此反复操作 计算每 次达到浑浊时 PEG和盐在系统总量中的质量分数 将实验数据填入表中 以 PEG的质量分数为纵坐标 某种盐的质量分数为横坐标作图 即得到一条双节线 的相图 表1相图制作表 编 号 水 g NH4 2SO4 溶液加量 g 纯 NH4 2SO4 累计量 g 溶液累计总 量 g NH4 2SO4质量分 数 PEG 质 量分数 10 53 13150 8954 378620 44 79 20 32 17921 51865 951121 853 02 30 32 04562 19 286722 652 26 40 33 13723 012 673823 681 65 50 56 07694 719 327624 521 08 60 56 19096 526 013825 020 8 70 56 85858 533 459625 320 62 根据以上数据以 NH4 2SO4质量分数为横坐标 以PEG质量分数为纵坐标即可 做出相图 二 二 双水相系统比例的选择双水相系统比例的选择 PEG4000与MgSO4双水相图 y 0 0995x2 5 3887x 73 334 R2 0 9973 0 1 2 3 4 5 6 20212223242526 MgSO4 PEG4000 根据相图 选择五个成相比例 三 蛋白酶酶活标准曲线的绘制 Folin酚法或紫外分光光度法 紫外分光光度法测蛋白酶酶活 1 原理 蛋白酶在一定的温度与 pH 条件下 水解酪素底物 然后加入三氯乙酸终止 酶反应 并使未水解的酪素沉淀除去 滤液对紫外光有吸收 可用紫外分光光 度法测定 根据吸光度计算其酶活力 酶活单位的定义 每 1mL 粗酶液 在一 定温度和 pH 值条件下 1min 水解酪素产生 1ug 酪氨酸为一个酶活力单位 以 u mL 表示 2 试剂和溶液 2 1 三氯乙酸 c 0 4mol L 称取三氯乙酸 65 4g 用水溶解并定容至 1000 mL 2 2 氢氧化钠溶液 c NaOH 0 5mol L 2 3 盐酸溶液 c HCl 1 mol L 及 0 1 mol L 1mol L HCl 取 90mL 浓盐酸溶解于去离子水中 定容至 1000mL 0 1mol L HCl 取 9mL 浓盐酸溶解于去离子水中 定容至 1000mL 2 4 缓冲溶液 a 磷酸缓冲液 pH 7 5 适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H2O 6 02g 和磷酸二氢钠 NaH2PO4 12H2O 0 5g 加水溶解并定容至 1000mL b 乳酸缓冲液 pH 3 0 适用于酸性蛋白酶 甲液 称取乳酸 80 90 10 6g 加水溶解并定容至 1000 mL 乙液 称取乳酸钠 70 16g 加水溶解并定容至 1000 mL 使用溶液 取甲液 8 mL 加乙液 1 mL 混匀 稀释一倍 即成 0 05moi L 乳酸 缓冲溶液 c 硼酸缓冲溶液 pH 10 5 适用于碱性蛋白酶 甲液 称取硼酸钠 硼砂 19 08g 加水溶解并定容至 1000 mL 乙液 称取氢氧化钠 4 0g 加水溶解并定容至 1000 mL 使用溶液 取甲液 500 mL 乙液 400 mL 混匀 用水稀释至 1000mL 上述各种缓冲溶液 均须用 pH 计校正 2 5 10g L 酪素溶液 称取酪素 1 000g 精确至 0 001g 用少量 0 5mol L 氢氧化钠溶液 若酸 性蛋白酶则用浓乳酸 2 3 滴 湿润后 加入适量的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80 mL 在沸水浴中边加热边搅拌 直到完全溶解 冷却后 转入 100 mL 容量 瓶中 用适宜的 H 缓冲溶液稀释至刻度 此溶液在冰箱内贮存 有效期为三 天 2 6 100ug mL L 酪氨酸标准溶液 a 称取预先于 105 干燥至恒重的 L 酪氨酸 0 1000g 精确至 0 0002g 用 1mol L 盐酸 60 mL 溶解后定容至 100 mL 即为 1mg mL 酪氨酸标准溶液 b 吸取 1mg mL 酪氨酸标准溶液 10 00 mL 用 0 1mol L 盐酸定容至 100 mL 即得到 100ug mL L 酪氨酸标准溶液 此溶液在冰箱内贮存或立即使用 3 仪器和设备 3 1 恒温水浴 40 0 2 3 2 紫外分光光度计 4 分析步骤 4 1 求K值 按下表配制不同浓度的 L 酪氨酸标准溶液 然后 直接用紫外分光光度计 于 275nm 测定其吸光度 A 以吸光度A为纵坐标 酪氨酸的浓度c为横坐标 绘制标准曲线 此线应通过零点 根据作图或用回归方程 计算出当吸光度 为 1 时的酪氨酸的量 g 即为吸光常数K值 其K值应在 130 135 范围内 管 号酪氨酸标准溶液的 浓度 g mL 取 100ug mL 酪 氨酸标准溶液的 体积 mL 取水的体积 mL 吸光值 Abs 000100 110190 050 220280 105 330370 185 440460 250 550550 341 4 2 测定 吸取适量稀释的酶液 2 00mL 酪素 2 00mL 三氯乙酸 4 00 mL 其它操作 条件同福林法测定中的反应 静止沉淀 直到过滤 滤液用紫外分光光度计 在 275nm 波长下 用 10mm 比色皿 测定其吸光度 A a 先将酷素溶液放入 40 0 2 恒温水浴中 预热 5min b 按下列程序操作 试管 A 空白 试管 B 酶试样 需作三个平行试样 加酶液 2 00 mL 加酶液 2 00 mL 40 0 2 2min 40 0 2 2min 加三氯乙酸 4 00 mL 摇匀 加酪素 2 00mL 已预热 摇匀 40 0 2 10min 精确计时 40 0 2 10min 精确计时 加酪素 2 00mL 已预热 摇匀 加三氯乙酸 4 00mL 摇匀 继续加热 10min 过滤或离心 继续加热 10min 过滤或离心 于 275nm 波长 测上清液吸光值 于 275nm 波长 测上清液吸光值 c 1 398 和 166 蛋白酶 除反应与显色温度为 30 0 2 外 其它操作同 4 2 标准曲线作同样处理 5 计算 酪氨酸标准曲线 y 0 0064x R2 0 9848 0 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 0 35 0 4 0102030405060 酪氨酸标准溶液浓度 ug ml Abs 在 40 下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生 1 g 酪氨酸 定义为 1 个蛋白酶活 力单位 X A K 8 2 1 10 n E 2 5 A K n E 式中 X 样品的酶活力 u mL A 试样溶液的平均吸光度 K 吸光常数 8 反应试剂的总体积 mL 2 吸取酶液 2 00mL 1 10 反应时间 10min 以 1min 计 n 稀释倍数 E 紫 外 法 与 福 林 法 的 换 算 系 数 中 性 碱 性 蛋 白 酶 系 数 为 0 5 0 酸 性 蛋 白 酶 系 数 为 0 7 7 所得结果表示至整数 6 结果的允许差 平行试验测定值之差不得超过3 四 四 双水相系统在蛋白酶分离中的应用双水相系统在蛋白酶分离中的应用 利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化 确定一个最佳分离体系