克隆形成实验

1 3 克隆形成实验克隆形成实验 细胞生长状况有关指标的检测方法 一 细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一 所用材料为血球计数板 巴氏吸管和显微镜 细胞计数的基本步骤 1 取清洁计数板和专用盖玻片 用丝绸布轻轻拭干 2 取细胞悬液 0 3mL 加入 0 9mL 结晶紫 或台盼至 染液 混匀后滴半滴于血球计数板内 以充满不外 溢为宜 也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中 不要溢出 也不要过少或出现气泡 3 在显微镜下用 10 物镜观察计数四角大分格中的细胞数 代入下式得出细胞密度 细胞数 ml 4 大格细胞数之和 4 104 稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率 一般 0 5 1 的台盼蓝染液可使死 细胞染成蓝色 活细胞不着色 此外还可用 0 02 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色 或用 0 05 的苯胺黑染液将死细胞染成黑色 细胞存活百分率 4 大格活细胞数 4 大格活细胞 死细胞数 100 细胞计数除用上述方法外 目前还有新型的自动计数仪 可供大规模细胞计数工作使用 各种型号的计数 操作不尽相同 可根据使用说明进行操作 在进行细胞计数操作时 必须把细胞悬液准备好 细胞应分散良好 并充分混匀 若出现较多细胞团或细 胞数少于 200 个 10mm2 或多于 500 个 10mm2 时 需重制细胞悬液 重新计数 二 细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标 是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便 方法 常用的方法为 在同一规格的培养瓶中 接种同等量的同一代细胞 经培养后每隔 24 小时取出几 瓶细胞进行计数 以培养时间为横座标 不同时刻的细胞数的对数为底座标 标出各点并连成线 即为该 细胞的生长曲线 可反应出细胞生长的动态 测定生长曲线的另一种方法是用 96 孔 24 孔细胞培养板 分 7 组 每组 3 孔 培养一周 7 天 期间逐日 检测一组 计数 最后把 7 天中的细胞数值绘成图 即为细胞生长曲线 也可采用 MTT 法来进行生长曲线测定 较上述方法简便 标准的细胞生长曲线近似 S 形 一般在传代后第一天细胞数有所减少 经过一段时间的潜伏期 再进入 对数生长期 达到平台期和生长稳定 最后衰老 细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度 经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率 生长倍数 培养后最大活细胞浓度 接种时的活细胞浓度 三 细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标 它以被测 1000 个细胞中的分裂细胞数来计算 其方法为 用秋水仙素将细胞处理 1 2 小时后 按染色体制片法制片并染色 计算 1000 个细胞中分裂相的数目 重复 4 次取平均值 用百分比表示 基本步骤 1 细胞准备 用盖片 支持物 培养法 2 每 24 小时取出一个小玻片 按常规方法进行固定 吉姆萨或 HE 染色 封片 制成永久标本 3 显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数 逐个视野进行 对每一时间组的玻片各取细 胞多 中 少 3 个区域各一区 共数 1000 个细胞 计算出平均分裂相值所占百分比 观察时要掌握好分 裂相标准 主要是确定好划分间期和前期 末期和间期等的界限 以减少误差 细胞分裂指数 细胞分裂相数 细胞总数 1000 1000 2 3 四 细胞接种存活率 细胞接种存活率又称细胞贴壁率 它是细胞被制成分散的悬液后 以低密度 2 5 个细胞 cm2 被接种到 底物上 贴壁并能存活生长形成细胞小群 克隆 的细胞百分数值 用以表示细胞的生存能力和细胞群的活 力 基本步骤 1 取对生长期细胞 用消化法制成细胞悬液 计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则 将细胞 接种于培养瓶 浓度相对高些 接种 12 15 瓶 2 每 2 小时取出一瓶细胞 倒掉培养液 然后加入胰酶消化已贴壁细胞 计数已贴壁细胞 用下面公 式逐个计算每个时间上的贴壁率 每 2 小时一次 共观察 24 小时即 12 接种存活率 贴壁率 贴壁存活细胞数 接种细胞数 100 五 克隆形成率 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆 而形 成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状 由于细胞生物学性状不同 细胞克隆形成率差别也很大 一般初代培养细胞克隆形成率弱 传代细胞系强 二倍体细胞克隆形成率弱 转化细胞系强 正常细胞克隆形成率弱 肿瘤细胞强 并且克隆形成率与接种 密度有一定关系 做克隆形成率测定时 接种细胞一定要分散成单细胞悬液 直接接种在碟皿中 持续一 周 随时检查 到细胞形成克隆时终止培养 1 平板克隆形成试验 基本步骤 1 取对数生长期的单层培养细胞 用 0 25 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞 把细胞悬浮在 10 胎牛血 清的 RPMI1640 培养液中备用 2 将细胞悬液作梯度倍数稀释 以适当的细胞密度 根据增殖能力 接种于培养皿中 一般分每皿 50 100 200 个细胞的梯度密度分别接种含 10mL 37 预温培养液的皿中 并轻轻转动 使细胞分散均 匀 置 37 5 CO2 及饱和湿度的环境下 静置培养 2 3 周 3 经常观察 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时 终止培养 弃去上清液 用 PBS 小心浸洗 2 次 加纯 甲醇或 1 3 醋酸 甲醇 5mL 固定 15 分钟 然后去固定液 加适量 Giemsa 应用染色液染 10 30 分钟 然后用流水缓慢洗去染色液 空气干燥 4 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片 用肉眼直接计数克隆 或在显微镜 低倍镜 计数大于 10 个 细胞的克隆数 最后计算克隆形成率 克隆数 克隆形成率 100 接种细胞数 平板克隆形成试验方法简单 适用于贴壁生长的细胞 适宜底物为玻璃的 塑料瓶皿 试验成功的关键是 细胞悬液的制备和接种密度 细胞一定要分散得好 不能有细胞团 接种密度不能过大 2 软琼脂培养克隆形成试验 基本步骤 1 取对数生长期细胞 用 0 25 胰蛋白酶消化并轻轻吹打 使之成为单细胞 作活细胞计数 用含 20 胎牛血清的 DMEM 培养液调整细胞密度至 1 106 细胞 L 然后根据实验要求作梯度倍数稀释 2 用蒸馏水分别制备出 1 2 和 0 7 两个浓度的低溶点琼脂糖液 高压灭菌后 维持在 40 中不会凝固 3 按 1 1 比例使 1 2 的琼脂糖和 2 DMEM 培养基 含有 2 抗生素和 20 的小牛血清 混合后 取 3mL 混 合液注入直径 6cm 平皿中 10cm 平皿加 7 10mL 冷却凝固 可作底层琼脂置 CO2 温箱中备用 3 3 4 按 1 1 比例让 0 7 的琼脂糖和 2 DMEM 培养基在无菌试管中相混以后 再向管中加入 0 2mL 的细胞 悬液 充分混匀 注入铺有 1 2 琼脂糖底层平皿中 逐形成双琼脂层 待上层琼脂凝固后 置入 37 5 CO2 温箱中培养 10 14 天 5 把平皿放置在倒置显微镜下 观察细胞克隆数 计算形成率 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系