RPN4的生理功能及其降解研究

RPN4 的生理功能及其降解研究的生理功能及其降解研究 摘要 泛素 蛋白酶体降解系统一直是胞内用来清除异常的蛋白 质和选择性降解各种生化过程中调控蛋白的执行者 它可以降解错 误折叠的蛋白也可以及时更新细胞周期过程中的调控因子 对细胞 的各种生化过程进行精密的调节 从而可以将胞内的蛋白质总量维 持在一个相对恒定的水平 保证正常生命活动的规律性 芽殖酵母 的 RPN4 RegulatingParticleNoneATPase 4 基因 亦称 SON1 和 UFD5 最开始是作为温度敏感株的抑制子 Suppressor 被发现的 即 PRN4 的失活突变可以恢复 sec63 101 在限制温度下的生长缺陷 后 来发现 RPN4 基因的突变还可以稳定泛素融合底物 UFDpathway 的底物 UB V gal 在不影响其多聚泛素化的情况下 阻碍 26S 蛋 白酶体对它的降解 因此亦被命名为 UFD5 以前的研究表明在蛋 白酶体的 32 个亚基中有 26 个基因的上游启动子区域含有 PACE Proteasome associatedcontrolelement 序列 而 RPN4 正是这段 顺式转录元件的反式转录因子 并且其自身的降解也必须靠蛋白酶 体来实现 这暗示了一种负反馈调控机制的存在 RPN4 上调蛋白 酶体亚基的水平 上调的亚基组装成有活性的蛋白酶体又反过来降 解自身的转录激活因子 从而将其下游转录产物 蛋白酶体亚基 维持在一个相对恒定的水平 保证细胞正常的生命活动 本论文的 结果提供了直接的证据证明负反馈调控机制的存在 首先在两种不 同的蛋白酶体活性受损的菌株内观察到 RPN4 蛋白的半衰期大大延 长 稳定性明显升高 随后检测受其调控的下游蛋白酶体亚基的水 平 发现与野生型相比 在蛋白酶体活性受损的突变型酵母菌株内 其各个亚基的丰度都有大幅度提高 Northern 检测证实这种升高是 由转录水平的增强引起的并且随着 RPN4 稳定性的增加而增加 这 些结果都表明在蛋白酶体活性受损的菌株内由于对 RPN4 的降解能 力减弱 增加了 RPN4 在细胞内的丰度 上调了其各个亚基的转录 水平 从而在数量上对胞内受损的蛋白酶体给与补充 使其达到新 的动态平衡 维持细胞正常的蛋白酶体活力水平 之后我们做了大 量的酵母菌株表型测试试验 结果与预想的一致 在蛋白酶体单亚 基突变造成的活性受损菌株中酵母的存活率与生长速度都与野生型 相差无几 但是当在实验中同时损伤蛋白酶体的活性并去除 RPN4 介导的负反馈调控机制之后 菌株就表现出强烈的合成致死效果 存活率大大降低 生长速度也十分缓慢 可见在 RPN4 缺失的情况 下 受损的蛋白酶体无法在数量上得到补给 给菌株的生长带来了 毁灭性的灾害 此外 为了研究蛋白酶体 关键词 RPN4 蛋白 酶体泛素依赖性降解 UBR2RAD6 负反馈调控 学位授予单位 华东师范大学 学位级别 博士 学位授予年份 2006 分类号 Q936 目录 中文摘要 9 12 英文摘要 12 17 第一章 RPN4 对 26S 蛋 白酶体的负反馈调控 17 34 摘要 17 18 前言 18 19 材料与方法 19 23 结果 23 261 26S 蛋白酶体活性受损稳定了 RPN4 并导致其下游基因 PRE6 表达量上升 232 26S 蛋白酶体活性受损导致其自身亚基的转录 水平上升 23 243 26S 蛋白酶体活性受损的菌株内亚基表达量的升高 是 RPN4 依赖性的 244 RPN4 稳定性的增强可以直接诱导蛋白酶体亚 基表达量升高 24 26 讨论 26 27 版图与说明 27 34 第二章 RPN4 蛋白 酶体负反馈调控对蛋白酶体突变株存活和生长的影响 34 45 摘要 34 35 前言 35 36 材料与方法 36 37 结果 37 391 在蛋白酶体活性受损的 菌株内同时缺失 RPN4 会导致强烈的合成致死 37 382 在 RPN4 基因 缺失的菌株内表达末端带有 TAG 的蛋白酶体亚基 PRE2 同样导致强 烈的合成致死 38 393 精确测量上述不同基因型的子代酵母和亲本酵 母在生长速度和存活率方面的差异 39 讨论 39 42 版图与说明 42 45 第三章 DNA 损伤修复中的 RPN4 蛋白酶体反馈调控 45 57 摘要 45 46 前言 46 47 材料与方法 47 49 结果 49 501 在 DNA 损伤试剂 MMS 作用下 蛋白酶体表达量的上升是 RPN4 依赖的 49 502 验证在 DNA 损伤试剂 MMS 作用下 RPN4 蛋白酶体反馈调控机制的存在 50 讨论 50 52 版图与说明 52 57 第四章 RPN4 泛素依赖的降解途径的 E3 UBR2 的发现 57 68 摘要 57 58 前言 58 材料与方法 58 59 结果 59 611 在所有已知的 E3 中 只有 UBR2 的缺失才能稳定 RPN4 11 229 59 602UBR2 的缺失使得全长 RPN4 的稳定性增强 60 61 讨论 61 62 版图与说明 62 68 第五章 RPN4 多聚泛素化反应中 E2 的发现以及体 外重建整个泛素化反应过程 68 81 摘要 68 69 前言 69 70 材料与方法 70 73 结果 73 751 可以与 UBR2 结合的蛋白 RAD6 的缺失使 RPN4 1 10 稳定 73 742 底物蛋白 RPN4 1 10 和 RPN4 1 10 10R 都可以与 E3 UBR2 结合 743 只有在 UBR2 RAD6 同时存在的情况下 RPN411 531 才可以发生多聚泛素化反应 74 75 讨论 75 77 版图与说 明 77 81 第六章蛋白酶体活性受损的情况下 RPN4 在胞内累积对酵 母细胞生长状况的影响 81 96 摘要 81 82 前言 82 83 材料与方法 83 85 结果 85 881UBR2 缺失的菌株内蛋白酶体亚基 PRE1 的表达量上 升 85 862UBR2 缺失的菌株内过量表达 RPN4 对酵母的生长没有显 著的影响 863 在蛋白酶体活性受损的菌株内过量表达 RPN4 严重影 响菌株的存活 86 874 在蛋白酶体活性受损的菌株内过量表达丧失了 转录活性的 RPN4 对酵母细胞的生长没有影响 87 885