蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究

蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究 博士学位论文蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究作 者姓名张秋红指导教师 陈航榕研究员中国科学院上海硅酸盐研究所 学位类别 理学博士学科专业 物理化学培养单位 中国科学院上海硅 酸盐研究所2019年年6月Study onConstruction ofProtein Based FunctionalNano Biomaterials andEfficient TumorTreatment Adissertation submittedto Universityof Chinese Academy of Sciences inpartial fulfillmentof therequirement for the degreeof Doctorof Philosophyin PhysicalChemistry ByQiuhong ZhangSupervisor Professor HangrongChen ShanghaiInstitute ofCeramics ChineseAcademyofSciencesJune2019中国科学院大学研 究生学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文是本人在 导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果 尽我所知 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 对论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体 均已在文中 以明确方式标明或致谢 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 作者签名日期中国科学院大学学位论文授权使用声明本人完全了解 并同意遵守中国科学院有关保存和使用学位论文的规定 同意中国 科学院上海硅酸盐研究所保留并向国家有关部门和机构送交论文的 复印件和电子版 允许该论文被查阅和借阅 本人授权中国科学院上海硅酸盐研究所可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复 制手段保存 汇编本学位论文 涉密及延迟公开的学位论文在解密或延迟期后适用本声明 本学位论文属于 保密 在年解密后适用本授权书 不保密 作者签名导师签名日期日期摘要中国科学院上海硅酸盐研究所博士 学位论文I摘摘要随着纳米医学概念的提出和深入研究 纳米技术为 癌症的早期诊断和精准治疗开辟了一条新的道路 蛋白作为一种天然的生物大分子 拥有良好的生物相容性 独特的 三维构象和自身特有的功能 在生物医学领域显示出良好的应用潜 力 本论文围绕不同组成蛋白自组装体系的创新合成 系统开展了基于 蛋白的纳米生物材料的设计合成及其肿瘤高效治疗研究 相关研究 为医学转化的纳米生物材料的构建提供了重要的参考 具体包括以 下几方面的研究内容 1 构建体内快速代谢的生物环境响应型纳米平台用于氧增强型放 疗的研究本研究设计合成了一种具有生物环境响应的过氧化氢酶修 饰的硫化铋白蛋白纳米复合体系 其在正常组织的中性pH条件下容 易解体为小尺寸的材料 有利于从正常组织中快速代谢清除 有效 地规避了纳米材料长期滞留在正常组织中引起的潜在风险 而通过E PR效应富集在肿瘤部位的纳米复合物在弱酸性的肿瘤微环境中相对 稳定 并且修饰的过氧化氢酶可以催化肿瘤微环境中的H2O2分解产 生氧气 一定程度上缓解了肿瘤乏氧 硫化铋纳米颗粒的放射增敏结合肿瘤乏氧的缓解 显著增强了肿瘤 放疗的治疗功效 因此 所构建的纳米复合体系既有效克服乏氧肿瘤细胞的耐放射性 提高放射增敏剂对肿瘤放疗的增强效果 又减少其在正常组织中 的长期滞留 提高治疗安全性 2 镶嵌放射增敏剂于负载药物的铁蛋白外壳用于肿瘤联合治疗的 研究为了规避抗癌药物对正常组织的副作用 并提高单一化疗的治 疗功效 本研究设计合成了一种新型的基于铁蛋白的肿瘤诊疗剂材 料 铁蛋白空腔内装载的抗癌药物可选择性地在肿瘤细胞的酸性溶酶体 中释放 并诱导肿瘤细胞死亡 铁蛋白多肽外壳镶嵌的放射增敏剂硫化铋纳米颗粒既可以增强铁蛋 白的结构稳定性 防止药物在体循环过程中泄露 又可以作为CT造 影剂为癌症治疗提供影像导航 还能够作为放射增敏剂提高放疗对 肿瘤细胞的杀伤力 与化疗共同发挥治疗作用 有效抑制肿瘤的生 长 显著提高小鼠的存活率 3 设计主动靶向和肿瘤深穿透性能的新型声敏剂材料用于肿瘤声 动力治蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究II中国科 学院上海硅酸盐研究所博士学位论文疗研究活性氧介导的肿瘤声动 力治疗模式具有高的选择性 无辐射 无创伤和深层组织穿透性等 优点 但是活性氧的寿命和扩散距离短 不能实现肿瘤的深穿透 导致活性氧介导的肿瘤声动力治疗功效差 本研究采用转铁蛋白和声敏剂卟啉自组装合成了一种新型的纳米声 敏剂 该声敏剂材料继承了转铁蛋白的主动靶向和细胞内循环能力 能够 特异性地识别转铁蛋白受体过表达的肿瘤细胞 被肿瘤细胞靶向吞 噬 并在肿瘤细胞间连续传递实现肿瘤的深穿透 在外源超声的触发下 瘤内深穿透的纳米声敏剂产生了大量的活性 氧 高效抑制了肿瘤的生长 关键词蛋白纳米材料 自组装 活性氧 联合治疗 代谢清除Abstr act中国科学院上海硅酸盐研究所博士学位论文III AbstractWith theproposal andin depth researchof nanomedicine nanotechnology hasopened a new avenuefor theearly diagnosisand precisetreatment ofcancer As anatural biomacromolecule protein hasgood biopatibility unique threedimentional conformationand inherentfunctionalities displaying considerablepotentials forpratical applicationsin bio medicine Herein focus on the innovativesynthesis ofself assembly systemsof differentprotein ponents we havesystematically carriedout thesynthesis ofprotein based nano biomaterials andthe researcheson effectivetreatments of tumors which willbe ofgreat guidancefor theconstruction ofclinically applicablenano biomaterials The researchincludes thefollowing contents 1 A bioenvironment responsive versatilenanoplatform enablingrapid clearanceand effectivetumor homingfor oxygen enhanced radiotherapy RT Bismuth sulfide albumin positenanospheres followedby catalaseconjugation denoted asBSNSs CAT has beenwell constructedas abioenvironment responsive nanoplatform The BSNSs CAT phagocytosedby normalcells demonstratearchitecture disintegrationinto smallone inresponse tophysiological pH achieving smallsize favored rapidclearance which largelymitigates theconcern oflong term toxicityof BSNSs CAT in normal tissues While BSNSs CAT remainarchitecturally stablein mildacidic tumormicroenvironment TME which stronglyfavors toresponse withH2O2overproduced TME As aresult the producedintratumor oxygencould overetumor hypoxia associated RTresistance together with the radiosensitization effect ofbismuth collectively enhancingRT efficacy Therefore the constructedBSNSs CAT caneffectively overethe RTresistance ofhypoxic tumorcells improving theenhancement effectof radiosensitizer and simultaneouslyreduce itslong term retentioninnormal tissues ensuring thehigh safetyof thetreatment 2 Inlaying radiosensitizeronto the polypeptide shellof drug loaded ferritinfor imagingand binationalchemo radiotherapy To avoidthe sideeffects offree蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究IV中国科 学院上海硅酸盐研究所博士学位论文anticancer drugs onnormaltissuesand improve the efficacyof sucha monotherapymodality herein anovel ferritinnanotheranostic wassynthesized The Doxmolecules encapsulatedin theinterior of ferritin canselectively releasein themildly acidiclysosome partmentand inducecancer cellsdeath consequently While thebismuth sulfidenanocrystals ontothepolypeptideshell canstrengthen thearchitectural stabilityofferritinto preventdrug burstleakage act asexcellent putedtomography contrastagents forin vivoimaging guided cancertreatment and simultaneouslyenhance RTefficacy basedontheradio sensitizationeffect which cooperateswiththedoxorubicin benefitedchemotherapy significantly inhibitthe tumor growth andimprovethesurvival rateoftumor bearing mice 3图1 3多功能树枝状大分子作为造影剂和药物递送系统示意图 22 b 上转换纳米颗粒和介孔氧化硅复合的示意图和TEM图 31 c Ti3C2纳米片的SEM和TEM图 37 b HSA Ce6NAs的TEM图 c HSA Ce6NAs经GSH处理24h后的TEM图 45 d HSA ICG NPs的合成示意图 e HSA ICG NPs的TEM图 f HSA ICG NPs用于PTT PDT协同治疗的示意图 g 4T1原位肿瘤经不同模式治疗后的生长曲线 h 小鼠的存活率 46 b IR825和HSA组装成纳米颗粒示意图 49 c 金属卟啉和HSA组装成纳米颗粒示意图 50 d IR DBI和HSA组装成纳米颗粒示意图 51 b HSA Ce6 Mn2 PTX RGD合成示意图 53 c ICG TPZ HSA dNMs用于肿瘤级联治疗示意图 54 b BSA辅助合成Gd2O3复合纳米颗粒的示意图 60 经过不同模式治疗后小鼠的 b 肿瘤生长曲线 c 小鼠存活率 和 d 体重变化曲线 65 b Fn的TEM图 c CuS Fn NC的TEM图 d CuS Fn NC 20 g mL 在不同激光功率照射下的升温曲线 e 荷瘤鼠在不同激光功率照射5min后的热成像图 f 经不同模式治疗后荷瘤鼠的肿瘤生长曲线 69 b 纳米药物载体DD MCT穿越血脑屏障进入脑部示意图 c 纳米药物载体DD MCT通过酸响应穿越血脑屏障内皮细胞放大图 78 b Tf IR780NPs的制备和用于肿瘤光热和光动力治疗示意图 80 b c BSNSs CAT作为生物环境响应通用纳米平台用于同时快速清除 有效肿瘤富 集和氧增强型放疗的示意图 b BSNSs的低倍TEM图 c d BSNSs的高倍TEM图 BSNSs的STEM图 e SEM f 明场TEM和 g 暗场TEM h BSNSs对应的元素mapping图 比例尺100nm c BSNSs和BSNSs CAT的水合动力尺寸 d BSNSs CAT BSNSs和CAT与H2O2溶液 100 M 反应后的产氧量 b BSNSs CAT分散在水 PBS和FBS中的照片 b 4T1细胞和BSNSs或BSNSs CAT C Bi 100 g mL 1 共孵育后在一系列的辐射剂量0 4 6 8Gy作用下的相对细胞存 活率 29图2 6BSNSs CAT在不同pH的PBS中分散6h 12h和24h的TEM图 插图是选区的高倍放大图 比例尺50nm b 区域3的EDX分析 c BSNSs CAT在生理pH下的解体过程示意图 b 注射BSNSs CAT后小鼠体内铋元素的排泄情况 5 10和15mg Bikg 1的BSNSs CAT到小鼠体内30天后的血液生化和血常规分析 5 10和15mg Bikg 1的BSNSs CAT静脉注射后 30天内的体重变化 BSNSs CAT的PA信号以绿色高亮显示 b 肿瘤区对应的PA信号强度 氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白分别用红色和蓝色表示 b 不同处理后肿瘤内sO2的定量比较 c 肿瘤切片的荧光照片 细胞核和乏氧因子分别用DAPI 蓝色所 示 和HIF 1 抗体染色 绿色所示 比例尺200 m b 第12天对照组和BSNSs CAT RT组小鼠的数码照片 c 各组小鼠12天内的体重变化 比例尺100 m b AFn Dox AFn和Dox AFBS溶液的水合动力尺寸 c Dox AFBS的XRD图谱 b Dox AFBS的高倍TEM图 c 图 b 的选区HRTEM图 d Dox AFBS的EDX分析 50图3 6AFn Dox AFn和Dox AFBS溶液的 a 荧光光谱和 b 紫外可见蛋白基功能纳米生物材料的构建及其肿瘤治疗研究中国科 学院上海硅酸盐研究所博士学位论文光谱 c Dox AFn和Dox AFBS在37 C pH7 4的缓冲液中存放3天的药物泄露分析 d Dox AFBS在37 C pH6 4和5 4的缓冲液中的药物释放 51图3 7 a 不同Dox浓度的紫外可见吸收光谱 b 由不同浓度Dox在480nm处的吸光度得到的标准曲线 b HeLa细胞和Dox AFBS共孵育4h和12h后的共聚焦荧光照片 细胞溶酶体被LysoTracker Green标记后发绿光 细胞核用DAPI染色后发蓝光 比例尺20 m b HeLa细胞与不同Bi浓度的AFBS共孵育24h后照射X射线进行剂量 为8Gy的放疗处理的相对细胞存活率 c HeLa细胞与不同Dox浓度的Dox Dox AFn和Dox AFBS共孵育24h 后的相对细胞存活率 d HeLa细胞与Dox AFBS共孵育24h后照射X射线进行剂量为8Gy的 放疗处理的相对细胞存活率 b CT造影与不同Bi浓度的Dox AFBS的线性相关性 c 荷瘤鼠体内注射Dox AFBS前后的CT影像 d 荷瘤鼠体内注射Dox AFBS后肿瘤内D