脂肪酶酶活测定方法

脂肪酶是一种特殊的水解酶 广泛地存在于动物组织 植物种子和微生物体中 是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生 单或双甘油酯和游离脂肪酸 将天然油脂水解为脂肪酸及甘油 同时也能催化酯合成和酯交换的酶 其在轻工 化工 医药 食品等行业有广泛的用途 近年来 随着非水酶学和界面酶学的不断深入 脂肪酶应用也不断地扩展 被广泛应 用于酯合成 手性化合物的拆分 化工合成中间体的选择性基团保护 高聚物的合成 肽合成等方面 应用前景广阔 脂肪酶在微生物中有广泛的分布 脂肪酶催化的反应是 甘油三酸酯 水 甘油二酸酯 游离脂肪酸 甘油酸酯 游离脂肪 酸 甘油 游离脂肪酸 脂肪酶只能在异相系统 即在油 水界面上作用 对水溶性底物无作用 这一点在有机合成中合 成手性中间体方面具有很多的优越性 1 滴定法 参照国家标准 适用于脂肪酶制剂 1 1 脂肪酶活力定义 为 1g 固体酶粉 或 1mL 液体酶 在一定温度的 pH 条件下 1min 水解底物产生 1 mol 的可滴定的脂肪酸 即为 一个酶活力单位 以 u g u mL 表示 1 2 测定原理 脂肪酶在一定条件下 能使甘油三酯水解成脂肪酸 甘油二酯 甘油单酯和甘油 所释放的脂肪酸可用标准碱溶液 进行中和滴定 用 pH 计或酚酞指示反应终点 根据消耗的减量 计算其酶活力 反应式为 RCOOH NaOH RCOONa H2O 1 3 仪器设备 恒温水浴箱 移液枪 高速匀浆机 pH 计 电磁搅拌器 1 4 试剂溶液 95 酒精 4 聚乙烯醇 PVA 聚合度 1750 50 称取 4g PVA 加蒸馏水 80mL 沸水中加热 并不断搅拌 使其完全溶解 慢速搅拌 以免产生过多气泡 冷却后定容至 100mL 用双层纱布过滤后备用 橄榄油 分析纯 底物溶液 按 4 聚乙烯醇 橄榄油 3 1 比例混合 用高速匀浆机处理 6min 分两次处理 间隔 5min 每次处理 3min pH7 5 磷酸缓冲液 称取十二水磷酸氢二钠 39 62g 磷酸二氢钾 1 96g 用水溶解并定容至 500mL 调节溶液的 pH 到 7 5 0 05 0 05mol L 氢氧化钠按 GB T601 配制与标定 使用时稀释 10 倍 10g L 酚酞指示液 GB T603 配制 1 5 待测酶液的制备 称取酶样品 1g 2g 精确至 0 0002g 用磷酸缓冲液溶解并稀释 如果是粉末 可加少量缓冲液研磨再稀释 测定 时控制酶液浓度 样品与对照消耗碱量之差控制在 1mL 2mL 范围内 1 6 测定 1 6 1 电位滴定法 按 pH 计使用说明书进行仪器校正 取两个 100mL 烧杯 分别作为空白 A 和样品 B 分别加入底物溶液 4mL 和缓冲液 5mL 再于 A 中加入 95 酒精 15 00mL 于 40 0 2 水浴中预热 5min 然后各加 1mL 酶液 立即混匀计时 准确反应 15min 后 于 B 中立即补加 15 00mL 95 酒精终止反应 取出 在烧杯中加入一转子 置于电磁搅拌器上 边搅拌 边用氢氧化钠标准溶液滴定 至 pH10 3 为滴定终点 记录 消耗氢氧化钠标准溶液的体积 1 6 2 指示剂滴定法 取两个 100mL 三角瓶 分别作为空白 A 和样品 B 分别加入底物溶液 4mL 和缓冲液 5mL 再于 A 中加入 95 酒精 15 00mL 于 40 0 2 水浴中预热 5min 然后各加 1mL 酶液 立即混匀计时 准确反应 15min 后 于 B 中立即补加 15 00mL 95 酒精终止反应 取出 于 A B 瓶中各酚酞两滴 用氢氧化钠标准溶液滴定 直至微红色并保持 30s 不退色为滴定终点 记录消耗氢氧 化钠标准溶液的体积 1 6 3 计算 脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算 式中 X1 样品的酶活力 u g V1 滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 单位为毫升 mL V2 滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 单位为毫升 mL c 氢氧化钠标准溶液 单位为摩尔每升 mol L 50 0 05mol L 氢氧化钠溶液 1 00mL 相当于脂肪酸 50 mol n1 样品的稀释倍数 0 05 氢氧化钠标准溶液浓度换算系数 15 反应时间 15min 以 1min 计算 4 讨论 影响脂肪酶测定结果有很多因素 其中底物 反应温度和 pH 因素影响最大 在滴定法中 以前国外有报导测定脂肪酶酶活时 不将底物制成乳化液 直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应 然后用碱滴定生成的脂肪酸 不乳化测得的结果平行性较差 这可能是反应过程中的随机误差引起的 因为不乳化时 反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中 水与油是互不相溶的 必然造成体系的不均匀 酶不能与底物充分接触 反 应不完全 因此测定的平行性较差 可比性也差