Car-T细胞培养标准操作流程

1 4 Car T细胞培养标准操作流程 1 目的 保证Car T细胞制备和培养符合要求 2 范围 适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养 3 责任人 实验员人 临床相关人员 4 内容 4 1耗材 50ml离心管 10ml移液管 5ml移液管 75cm2培养瓶 150 cm2培养 瓶 EP管 1 8ml冻存管 4 2试剂 X VIVO 15TM PBS缓冲液 75 医用酒精 人淋巴细胞分离液 CD3 CD28免疫磁珠 IL 2 注射用人血白蛋白 4 3环境 4 3 1外周血分离 培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行 开放操作必须在百 级生物安全柜内进行 4 3 2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒 紫外线照射时间 不少于30min 消毒消毒后 净化空调开启时间不少于30min 生物安全柜运行 稳定后方可操作 4 4操作 4 4 1采集接收外周血 4 4 1 1患者符合治疗方案 各项检测符合要求 采集患者外周血60 80ml 4 4 1 2接收外周血并填写 外周血采集交接记录 核对外周血患者相关信息 及相应检测报告 报告由医院提供 至少包括 HBsAg HCVAb HIVAb Anti TP ALT 4 4 2操作前准备 4 4 2 1净化室 生物安全柜消毒完毕后 开启净化空调运行30min 生物安 全柜运行稳定 4 4 2 2从试剂间冰箱中取出细胞培养基 恢复室温 4 4 2 3生物安全柜表面75 酒精消毒 外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内 4 4 3 分离单个核细胞 PBMC 4 4 3 1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器 把血袋 2 4 内外周血转入50ml离心管中 4 4 3 2用PBS缓冲液按1 1稀释外周血 混匀 4 4 3 3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中 方 法如下 用10ml移液管吸取血样 伸至分离液液面上方0 5cm处 血样自然滑落 铺至分离液面上 然后轻轻加入血样 注意不要冲破液面 4 4 3 4配平离心1200g 2100r min 离心20min 慢升慢降 4 4 3 5离心完成后 离心管出现明显分层由下至上 红细胞层 粒细胞层 Ficoll层 单个核细胞层和血浆层 吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之 小 心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中 PBS稀释 与细胞悬液体积比应大 于1 3 混匀 4 4 3 6离心600g 1600r min 5min PBS重悬细胞混匀 取少量细胞计数 4 4 3 7离心300g 1200r min 5min 上清液送检无菌检测 4 4 4细胞培养 4 4 4 1细胞培养条件 恒温37 CO2浓度 5 相对饱和湿度95 细胞培养 基PH值7 2 7 4 4 4 4 2根据细胞计数调密度2x106 ml加入培养瓶中 T150 200 x106 100ml T75 100 x106 50ml T25 50 x106 25ml 混匀放入CO2培养箱培养2小时 4 4 4 3取出培养瓶 轻摇 使沉降于底部的悬浮细胞浮起 培养瓶倾斜30度角 移液管吸取培养基转入离心管中 少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集 混匀计数 4 4 4 4根据细胞计数调整细胞浓度1 2x106 ml接种培养瓶中 100 120ml in a T150 50 60ml in a T75 15 29ml in a T25 加CD3 CD28磁珠 按细胞与 磁珠比例为1 3 加之前磁珠用培养基洗涤3次 去除保存液 加入IL 2 100U ml 混匀放入CO2培养箱培养 4 4 4 5次日细胞培养1天 调整细胞密度至0 6x106 ml 加入病毒 MOI为1 5 混匀放入CO2培养箱培养 4 4 4 6细胞培养3天 细胞计数补加培养基 IL 2 100U ml细胞密度调整至 0 6x106 ml继续培养 3 4 4 4 4 7细胞培养5天去磁珠 细胞混匀转离心管中 在磁力架上去除磁珠 细 胞计数补加培养基 IL 2 100U ml细胞密度调整至0 6x106 ml继续培养 4 4 4 8定期观察细胞生长情况 主要观察其形态的变化 数目及增值情况 细 胞碎片及杂质情况 每2 3天加液培养 4 4 4 9根据细胞状态和临床治疗需要 培养9天时细胞数量达到要求 各项检 测合格 包括 无菌检测 内毒素检测 细胞活力 细胞表型等 4 4 5 Car T细胞收集 4 4 5 1确认细胞各项检测己符合要求 4 4 5 2根据治疗方案 一般一个疗程分多次回输 间隔时间为1天 取出相 应细胞悬液 剩余细胞补加培养基继续培养 供再次回输 4 4 5 3细胞悬液转入离心管中 300g离心5min 4 4 5 4除去上清培养液 加PBS缓冲液稀释混匀 300g离心5min 弃上清 PBS 缓冲液300g min离心5min 4 4 5 5细胞装袋 一般静脉回输 采用100ml双阀盐水袋 离心完成后取上 清 做无菌检测 20ml生理盐水重悬细胞 100 m细胞滤网过滤 取少量细胞 悬液进行细胞数量 细胞活率 革兰氏检测 内毒素检测 细胞过滤完成 转入100ml盐水袋中 加5 注射用人血白蛋白 贴上标签 并填 写相关记录 4 5细胞运输与保存 4 5 1核对细胞标签内容 填写回输发放记录 4 5 2细胞盐水袋放置于运输容器内 一般为疫苗箱 4度 填写交接记录表 4 5 3运输人员在运输过程中避免距离震荡 并在规定时间内送到 4 5 4