花青素层析纯化方法综述

两种主要花青素分离纯化方法两种主要花青素分离纯化方法 1 组合柱层析色谱法 HPLC 分析 Li Rui 1 等 X 5 树脂和 Sephadex LH 20 结合的方法从 V uliginosum berry 里分离纯化得到 11 种花青素和两种多酚 具体操作方法 25 mL 提取液过 X 5 树脂 乙醇 0 5 TFA 处理 然后用 0 5 TFA v v 去离子水冲洗 2 次去除 多糖 有机酸等水溶性杂质 接着多酚由乙酸乙酯洗脱回收 0 5 TFA v v 乙 醇洗脱 4 次回收得到花青素 浓缩得到的花青素采用 Sephadex LH 20 色谱柱进 一步纯化 采用含有 0 5 TFA 的 30 乙醇水溶液为洗脱溶剂 洗脱下来的片 段采用分光光度法在 525nm 处检测 每部分洗脱液在 35 oC 真空下旋转蒸发 RE 52AA Yarong Shanghai China 至干燥 然后再用 0 5 TFA v v 溶液 溶解 分析前 20 oC 下保存 分析方法为 HPLC DAD ESI MS 和 MS MS 王二雷 2 等也分别采用组合层析和半制备型高效液相色谱的方法从野生蓝 莓中分离得到高纯度的花青素混合物和单体 利用 UV vis 和高效液相色谱对 花青素含量进行检测 利用 HPLC 和 HPLC DAD ESI MS MS 对纯化样品中 的花青素进行种类鉴定 首先 将野生蓝莓粗提液用乙酸乙酯萃取 4 次 将萃取之后的水相上 Amberlite XAD 7HP 20 60 目 Sigma Aldrich 阳离子交换柱 2 6 cm 50 cm 然后用 2 L 含 0 01 HCl 的去离子水以 1 mL min 的流速冲洗柱子 以去大部分 的除多糖 有机酸 蛋白和离子 用 1 L 35 的酸化乙醇溶液 0 01 HCl 做 为洗脱液 流速为 1 5 mL min 进行洗脱 根据柱中颜色边界层以及在 520 nm 处的 UV vis 检测结果进行洗脱液的收集 再浓缩 不超过 40 oC 冷冻干燥制 得花青素粗提物 用 300 mL 60 80 乙醇溶液 0 01 HCl 将弱极性的花青素 和其他酚类进行完全洗脱 备用 然后 取 0 1 g 经上一步树脂纯化的色素粗提物用 20 mL 去离子水溶解 上 Sephadex LH 20 层析柱 1 0 cm 60 cm Sigma Chemical Co St Louis MO USA 用 1 L 25 乙醇溶液 0 01 HCl 以 1 2 mL min 的流速洗脱 并用 10 mL 试管收集洗收集不同组分 分别浓缩 冷冻干燥制得蓝莓花青素纯化样品 最后 为了得到花青素的单体 将 LH 20 分离得到的各部分样品经半制备 型高效液相色谱进一步纯化 得到高纯度的花青素单体 研究优点 此采用采用乙醇 乙酸乙酯 盐酸等无毒或低毒溶剂 取代了 常规的剧毒有机溶剂比如甲醇 丙酮 三氟乙酸等 同样的 Giuliana Catalano 3 Luis Cabrita 4 Zhaoqi Zhang 5 等人也采用 Amberlite XAD 7 树脂和 Sephadex LH 20 柱层析的方法分别从毛野豌豆的花瓣 蓝莓和荔枝果皮中分离得到花青素 王峰 6 采用柱层析法对黑花生衣色素进行 分离纯化 方法流程为 黑花生衣 50 甲醇 含 0 1 三氟醋酸 浸提 浓缩 乙酸乙酯萃取 脱有机溶剂 XAD 7HP 大孔树脂纯化 聚酰胺纯化 葡聚糖凝 胶 LH 20 纯化 得到两种色素单体 Gary R Takeoka 7 等从黑豆中用固相萃取 硅藻土 和制备型 HPLC 法分离得到了 3 种花青素 2 高速逆流色谱和柱层析结合法 Andreas 8 等人采用 Amberlite XAD 7 树脂和高速逆流层析 HSCCC 的方 法从玫瑰茄 紫甘蓝 黑醋栗 黑果梨等中分离得到多种花青素 并对其抗氧 化性能进行测试筛选 具体过程为 先用 Amberlite XAD 7 层析柱 50 cm 4 cm Fluka Chemie Buchs Switzerland 对花青素粗提液进行初步纯 洗脱液组成为甲醇 乙酸 19 1 v v 洗脱液在真空下浓缩 然后冷冻干燥保存 接着采用高速逆流色谱进一 步纯化 高速逆流色谱设备配备 3 个串联的制备线圈 d 2 6 mm V 850 mL 转速为 1000 rpm 所用的溶剂体系组成为叔丁基甲醚 正丁醇 乙腈 水 2 2 1 5 并用三氟乙酸酸化 流速为 5 mL min 之前冷冻干燥的花青素产品用 1 1 体系 的轻相和重相溶解 由环式注射器进样 HPLC DAD TLC ESI MS MS 和 1H NMR 分析方法用来检测分离的花青素的纯度及分子式 Koichi 9 等建立了一套高速逆流色谱分离方法实现了花青素的纯化分离 两相溶剂系统的优选 Bo Li 10 等采用高速逆流色谱和 C18 反向色谱连用的方法从黑米中分离得到纯 度高达 94 38 的 Cyanidin 3 O d glucoside 花青素 具体方法 1 LC UV MS MS LC MSD trap Liquid Chromatography Mass Spectrometer Detector ion trap 液相色谱 质谱联用仪离子阱方法鉴定花青素种类 设备 Agilent 1100 series Palo Alto CA USA 配备 ESI electrospray ionization source 电喷射粒子化器和一个 DAD diode array detector 二极管阵列检测器 所用分离柱材料为 YMC ODS AQ 柱 3 m 150 mm 4 6 mm i d Kyoto Japan 流动相 A 为甲酸 8 5 91 5 v v B 相甲酸 甲醇 乙腈 水 8 5 22 5 22 5 41 5 v v v v 2 HPLC 法对高速逆流色谱两相溶剂系统的优选 根据分配系数 K 所用 两相溶剂系统的组成为 水 正丁醇 叔丁基甲基醚 乙腈 三氟乙酸 最佳比例根 据分配系数 K 和固定相的保留比例确定 3 经高速逆流分离得到的产品进一步用反向 C18 色谱进一步纯化 得到花 青素单体 YMC PACK ODS AQ C18 column 50 m 50 cm 3 cm i d 洗脱 剂为含 0 1 TFA 的 22 甲醇 流速为 2 mL min 4 最后再由核磁的碳普氢 普确认所分离物质 参考文献 1 Li R Wang P Guo Q Q and Wang Z Y Anthocyanin composition and content of the Vaccinium uliginosum berry Food Chemistry 2011 125 1 116 120 2 Wang E L Yin Y G Xu C N and Liu J B Isolation of high purity anthocyanin mixtures and monomers from blueberries using combined chromatographic techniques Journal of Chromatography A 2014 1327 31 39 48 3 Catalano G Fossen T and Andersenc M Petunidin 3 O Rhamnopyranoside 5 O glucopyranoside and other anthocyanins from flowers of vicia villosa Journal of Agricultural and Food Chemistry 1998 46 11 4568 4570 4 Cabrita L Fr ystein N Andersenc M Anthocyanin trisaccharides in blue berries of vaccinium padifolium 2000 69 1 33 36 5 Zhang Z Q Pang X Q Yang C Jia Z L and Jiang Y M Purification and structural analysis of anthocyanins from litchi pericarp Food Chemistry 2004 84 4 601 604 6 张天佑 王晓编著 高速逆流色谱技术 北京 化学工业出版社 2011 7 陈鹏 天然产物中抗氧化活性成分的高速逆流色谱分离研究 D 浙江大学 2014 8 Degenhardt A Knapp H and Winterhalter P Separation and purification of anthocyanins by high Speed countercurrent chromatography and screening for antioxidant activity Journal of Agricultural and Food Chemistry 2000 48 2 338 43 9 Li B Du W K Qian D Y Du and Q Z Combination of high speed countercurrent chromatography and reversed phase C18 chromatography for large scale isolation of cyanidin 3 O D glucoside from black rice bran extract Industrial Crops and Products 2012 37 1 88 92 10 Schwarz M Hillebrand S Habben S Degenhardt A and Winterhalter P Application of high speed countercurrent chromatography to the large scale isolation of anthocyanins Biochemical