蛋白质纯化胶体过滤法

不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱 可依其分子量差异分离 是一种广泛应用的 partition 色析法 Pharmacia 操作手册 Gel Filtration 仪器设备 色析管柱 Pharmacia C column 1 6 100 cm 铁架 铁夹及水平仪 部分收 集器 fraction collector 需准备干净试管约 100 支 浓缩用离心机 低速 5 000 rpm 浓缩用离心管 Centriprep 30 Amicon 4322 请注意其使用方法 药品试剂 胶体 Sephacryl S 300 Pharmacia a 预先以缓冲液 buffer A 150 平衡好 并且使完全沈降后的胶体体积 占全部体积的七至八成 要先预估好胶体的使用量 b 胶 体温度要与操作场所的温度一致 否则温度变化会产生气泡 c Sephacryl 系列胶体有相当 大的吸附力 因此要在缓冲液加入 0 15 M 以上的 NaCl 以除去非专一性吸附 Buffer A 150 注 意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 Bio Rad 151 1901 溶于 1 mL 后每组取 0 4 mL 含有 thyroglobulin 670 kD bovine gamma globulin 158 kD chicken ovalbumin 44 kD equine myoglobin 17 kD vitamin B12 1 350 方法步骤 管柱装填 1 以纯水冲洗玻璃管柱 以纯水上下冲洗即可 严禁使用试管刷 并请了解管柱的构 造与拆装方法 垂直架好管柱 以软管连接部分收集器 并以 bufferA 150 试看管路是否 通畅 可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管 则可控制溶离的进行 注意系统的摆设 要适当 不要装置于交通要冲 2 依预估量取出 Sephacryl 胶体 注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡 将瓶中的胶体 上下震荡 使的完全悬浮 但勿产生太多气泡 3 在管柱内加入约 10 cm 高缓冲液 然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱 一直加到管柱 顶端 开始流洗后胶体沈降很快 当胶体上方的液面逐渐降低时 可于顶端添加胶体 以 达所要高度 胶体高度约 90 cm 4 胶体完全沈降后 小心以 buffer A 150 加满管柱 关闭出口 装上顶端端盖并连通缓 冲液瓶 打开出口以重力流洗 调整缓冲液瓶高度 使流速约每五 六秒一滴 并设定收 集体积为 2 5 mL tube 5 胶柱流洗约 100 mL 后 关闭出口 拆开顶端端盖 先以滴管吸出胶体上方的溶液到 剩约 1 cm 高 注意勿破坏胶体表面平整 然后打开出口 使液面下降至胶体面 再关闭 出口 准备注入样本 样本色析进行 6 以微量移液器或滴管吸取样本 样本体积不得超过胶体总体积的 3 沿着胶体上方 管壁缓慢加入 注意切勿破坏胶体的平整表面 样本确实体积 mL 7 打开出口 同时开启部分收集器 当样本完全没入胶体时 关闭出口 缓缓加入与样 本相等体积的 buffer A 150 打开出口待其慢慢进入胶体中 如此重复二次 不得扰动胶体 表面 造成凹陷 8 暂时关闭出口 将液面高度加满至管柱顶端 并把顶端端盖锁上 然后打开出口开始 溶离 调整缓冲液瓶的高度 使流速为 6 s 一滴 9 要留心观察前面几个分划 确定整个系统运转无碍 小心部分收集器最容易出问题 管柱预计将流洗过夜 收集约 80 管 10 收集试管 进行蛋白质定量分析以及 GUS 活性测定 并请作图 11 收集 GUS 活性区 以 Centriprep 30 浓缩至 10 mL 后 加 buffer A 0 稀释至 20 mL 再 次浓缩至 mL GF 保留 100 L 12 管柱请再以 buffer A 150 流洗 100 mL 后 小心放置一旁 准备以后进行分子量测定 分子量测定 13 进行分子量测定前一天 请先以 buffer A 150 流洗 100 mL 并检查胶柱内有无气泡 产生 若有严重的气泡或干裂 必须重新装填管柱 14 取标准分子量溶液 0 4 mL 加上纯质目标酶 0 5 mL 以亲和层析法所得的 AF 部份 如上法注入管柱中 立刻开始进行胶体过滤 并收集各分划 请依循上述所有管柱及分划 收集器的操作要点 15 收集所得 进行蛋白质定量分析 可定出数个蛋白质尖峰 以作为分子量依据 另以 目测法 决定红色高峰的管数 则可定出 vitamin B12 的溶离管数 利用以上数据 可画出 分子量与溶离管数间的直线关系 作为分子量判定的标准校正线 16 同样的一批分划 请进行酶活性分析 GUS 则可定出酶的溶离体积 对照上述标 准校正线 则可求出酶的分子量 拆除管柱及保存胶体 17 若管柱长期不用 应当自管柱中取出胶体 以缓冲液清洗后 置冷藏室中保存 但绝 对不要放在冷冻箱中 胶体若装填太紧 有时可能不易取出 要有耐心地以缓冲液慢慢冲 出来 18 胶体可以加 0 01 NaN3 防止霉菌生长 但使用前记得要洗去 再度使用时 请检查 胶体中有无灰黑色霉菌颗粒 若有结块而不易打散者 也不要使用 实验材料Sephacryl S 300 胶体 试剂 试剂盒缓冲液 buffer A 150 仪器 耗材色析管柱铁夹试管铁架水平仪收集器浓缩用离心机 浓缩用离心管 实验步骤 一 仪器设备 色析管柱 Pharmacia C column 1 6 100 cm 铁架 铁夹及水平仪 部分收集器 fraction collector 需准备干净试管约 100 支 浓缩用离心机 低速 5 000 rpm 浓缩 用离心管 Centriprep 30 Amicon 4322 请注意其使用方法 二 药品试剂 胶体 Sephacryl S 300 Pharmacia a 预先以缓冲液 buffer A 150 平衡好 并且使完全 沈降后的胶体体积 占全部体积的七至八成 要先预估好胶体的使用量 b 胶体温度要与 操作场所的温度一致 否则温度变化会产生气泡 c Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力 因此要在缓冲液加入 0 15 M 以上的 NaCl 以除去非专一性吸附 Buffer A 150 注意使用时 的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 Bio Rad 151 1901 溶于 1 mL 后每组 取 0 4 mL 含有 thyroglobulin 670 kD bovine gamma globulin 158 kD chicken ovalbumin 44 kD equine myoglobin 17 kD vitamin B12 1 350 三 管柱装填 1 以纯水冲洗玻璃管柱 以纯水上下冲洗即可 严禁使用试管刷 并请了解管柱的构 造与拆装方法 垂直架好管柱 以软管连接部分收集器 并以 bufferA 150 试看管路是否 通畅 可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管 则可控制溶离的进行 注意系统的摆设 要适当 不要装置于交通要冲 2 依预估量取出 Sephacryl 胶体 注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡 将瓶中的胶体 上下震荡 使的完全悬浮 但勿产生太多气泡 3 在管柱内加入约 10 cm 高缓冲液 然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱 一直加到管柱 顶端 开始流洗后胶体沈降很快 当胶体上方的液面逐渐降低时 可于顶端添加胶体 以 达所要高度 胶体高度约 90 cm 4 胶体完全沈降后 小心以 buffer A 150 加满管柱 关闭出口 装上顶端端盖并连通缓 冲液瓶 打开出口以重力流洗 调整缓冲液瓶高度 使流速约每五 六秒一滴 并设定收 集体积为 2 5 mL tube 5 胶柱流洗约 100 mL 后 关闭出口 拆开顶端端盖 先以滴管吸出胶体上方的溶液到 剩约 1 cm 高 注意勿破坏胶体表面平整 然后打开出口 使液面下降至胶体面 再关闭 出口 准备注入样本 四 样本色析进行 1 以微量移液器或滴管吸取样本 样本体积不得超过胶体总体积的 3 沿着胶体上 方管壁缓慢加入 注意切勿破坏胶体的平整表面 样本确实体积 mL 2 打开出口 同时开启部分收集器 当样本完全没入胶体时 关闭出口 缓缓加入与样 本相等体积的 buffer A 150 打开出口待其慢慢进入胶体中 如此重复二次 不得扰动胶体 表面 造成凹陷 3 暂时关闭出口 将液面高度加满至管柱顶端 并把顶端端盖锁上 然后打开出口开始 溶离 调整缓冲液瓶的高度 使流速为 6 s 一滴 4 要留心观察前面几个分划 确定整个系统运转无碍 小心部分收集器最容易出问题 管柱预计将流洗过夜 收集约 80 管 10 收集试管 进行蛋白质定量分析以及 GUS 活性测定 并请作图 5 收集 GUS 活性区 以 Centriprep 30 浓缩至 10 mL 后 加 buffer A 0 稀释至 20 mL 再 次浓缩至 mL GF 保留 100 L 6 管柱请再以 buffer A 150 流洗 100 mL 后 小心放置一旁 准备以后进行分子量测定 五 分子量测定 1 进行分子量测定前一天 请先以 buffer A 150 流洗 100 mL 并检查胶柱内有无气泡产 生 若有严重的气泡或干裂 必须重新装填管柱 2 取标准分子量溶液 0 4 mL 加上纯质目标酶 0 5 mL 以亲和层析法所得的 AF 部份 如上法注入管柱中 立刻开始进行胶体过滤 并收集各分划 请依循上述所有管柱及分划 收集器的操作要点 3 收集所得 进行蛋白质定量分析 可定出数个蛋白质尖峰 以作为分子量依据 另以 目测法 决定红色高峰的管数 则可定出 vitamin B12 的溶离管数 利用以上数据 可画出 分子量与溶离管数间的直线关系 作为分子量判定的标准校正线 4 同样的一批分划 请