医学微生物学实验

医学微生物学实验,内 容 提 要,（一）内毒素的检测,目的 1 掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2 熟悉内毒素实验的意义。,检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎（hu）实验法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高，故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高，可检测小于10ng/ml的内毒素。,内毒素生物学活性：致热作用、白细胞反应、感染性休克 和DIC等。 原理： 鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。,材料： 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管,方法： （每4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照） 1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml 鲎试剂溶解水，使之溶解 2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记上实验组，另一支加入0.1ml溶解水，作为对照 3.垂直放入37温箱，20-30分钟观察结果结果： 实验组出现凝固，对照组不出现凝固,内毒素检测的应用： （1）检测输液用品或生物制品中是否 含有内毒素 （2）临床上检测患者是否有革兰氏阴性 菌感染引起的内毒素血症（内毒素 休克）等,二. 肠道致病菌的分离培养,2学时,肠道细菌的分离培养,一、培养基 概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物 制品。 成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机 盐）；合适的 PH，适宜的温度；适宜的气体 环境。 用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存， 鉴别微生的类属，研究微生物的生理及生化特 性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。,二、分类,培养基的制备程序,调配 过滤 矫正pH（7.0-7.6） 分装过滤 灭菌（121.3，20-30分钟） 鉴定是否有菌 放入冰箱冷藏备用因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养24小时，然后观察,肉汤培养基制作方法,1.将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉50克，加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。2.加热煮沸半小时至一小时后，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100 ml。3.于滤液中加入氯化钠0.5克，蛋白胨1克，磷酸氢二钾0.1克，加热使之完全溶化。,4.测定酸碱度并调至pH7.6，必要时用滤纸过滤。5.按需要分装于试管或烧瓶内，加棉塞，置高压蒸汽灭菌器内，经121.3、20-30分钟灭菌。6.灭菌后置37温箱孵育24小时，无杂菌生长，即可应用或放冰箱备用。,液体培养基加入1-2%的琼脂为固体培养基，加入0.5%琼脂为半固体培养基。固体培养基加入血液即为血平板（营养培养基）。,血液琼脂培养基（血平板）,在普通琼脂培养基的基础上加入血液制备而成,是最常用的营养培养基,可供营养要求较高的细菌生长.常用于分离培养和溶血现象观察.,含有胆酸盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长.含有中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红.常用于培养肠道致病菌.,SS培养基（Salmonella -Shigella Mediun）,SS培养基,肠道杆菌的生物学性状,埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌 甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌,肠杆菌科重要菌属及代表菌种,1 大肠杆菌: 生物学性状: G- 镜下为杆状， 多数菌株有周鞭毛，菌毛，无芽孢，兼性厌氧 营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长，发酵葡萄糖等,产酸产气 最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,肠道杆菌的生物学性状,菌落特点： 圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径2-3mm,肠产毒型大肠杆菌（轻度腹泻，肠毒素， 定植因子）肠侵袭型大肠杆菌（与志贺菌相关，与菌痢相似 里急后重， 不产生肠毒素）肠致病型大肠杆菌（最早发现的引起腹泻的 大肠杆菌，婴幼儿）肠出血型大肠杆菌（出血性结肠炎和溶血性 尿毒综合征的病原体， 轻 度水泻伴剧烈腹痛血便， 常见食品污染）肠集聚型大肠杆菌（婴儿和旅行者持续水样腹泻 偶有血便，不侵袭细胞， 在细胞表面自动聚集，形成 砖样排列）,分类：（胃肠炎）,（2）伤寒杆菌,生物学特性: G-镜下为杆状,有菌毛，除个别外都有周鞭毛，一般无荚膜，均无芽孢。兼性厌氧，营养要求不高,不发酵乳糖或者蔗糖，对葡萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，产酸不产气，其他沙门菌产酸产气，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,菌落特点: 圆形,凸起,无色，细小，半透明,表面光滑,湿润,直径2-3mm.,1、相似的形态染色从形态上无法区别,中等大小的G-杆菌,多有鞭毛、菌毛,肠道杆菌的生物学性状,2、活泼的生化反应,肠道杆菌的生物学性状,乳糖发酵试验,肠道杆菌的生物学性状,将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。 (每个实验室8个平板） (接种好后，做好标记，用胶布按班绑好) 放入37温箱中培养24小时。取出放4冰 箱中保存备用。,分离培养方法,三、消毒灭菌（2学时）,1. 细菌在自然界的分布及理化因素 对细菌的影响2. 高压蒸汽灭菌法,空气中细菌的检查（每个班1个平皿） 原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。 方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露放置15min，即盖上皿盖，放入37 培养24小时，观察结果。,1.1 细菌在自然界的分布,1.2.1紫外线对细菌的影响（每个实验室1个培养皿） 原理：紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上的两个相邻胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰DNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。对病毒也有破坏作用。 紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。普通玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。 紫外线中波长为240-300nm者具有杀菌能力，其中265-266nm的杀菌作用最强。 常用于消毒物体表面，手术室无菌实验室，传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。,1.2理化因素对细菌的影响,紫外线对细菌的影响,取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，置于紫外线下照射30分钟，然后盖好盖子，置37培养24h后取出观察结果。,1 促进菌体蛋白质变性或凝固。 2 干扰细菌酶系统和代谢。 3 损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理 结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。,1.2.2化学消毒剂对细菌的影响,有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物， 称为化学消毒剂； 浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂； （只能外用，对细菌的敏感性不同）,化学消毒剂对细菌的影响,化学消毒剂分类,1 高效消毒剂：杀灭细菌芽孢在内的所有微生物，适用于不 耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内 窥镜等。 次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等2 中效消毒剂：不能杀灭芽孢，但能杀灭繁殖体（包括结核 杆菌），真菌和大多病毒，如喉镜，麻醉器材 碘酊、乙醇等3 低效消毒剂：能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽孢， 结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。 新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等,影响消毒灭菌的因素,1 微生物的种类2 微生物的污染程度3 环境中的有机物4 消毒剂的性质、浓度与作用时间5 温度、湿度、酸碱度6 化学拮抗物,化学消毒剂对细菌的影响,方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37温箱培养24小时后观察。,（每个实验室2个平皿）,方法：用“打咳法”进行检查。 取一个血琼脂平皿培养基（咽喉部多为葡萄球菌），打开平皿盖，对着平皿咳嗽几次（口腔前约10厘米），然后放入37温箱培养24小时后观察菌落数量及特征。,咽喉部细菌的检查,2 高压蒸气灭菌法 原理：蒸汽被限制在密闭容器内，随着热力的作用压力不断升高，蒸汽的温度也相应升高，在103.4kPa蒸汽压力下时，温度可达121.3。维持1520分钟后可杀死细菌包括芽孢在内的所有微生物。,高压蒸气灭菌器,1)构造 高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。 高压蒸气灭菌器上装有排气阀、安全阀，以调节器内压力，装有的温度计及压力表以示内部温度和压力。 器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌对象。,高压蒸汽灭菌法,压力：1.05kg/ 或103.425KPa温度: 121.3时间：15-20min,完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢,用途：适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品， 如敷料、 手术器械、药品、细菌培养基等,全自动高压蒸汽灭菌锅,Systec D-200 2D 双门高压灭菌器,电热卧式圆形压力蒸汽灭菌器(型号YXQ-WY21-600),台式蒸汽灭菌器 BA-30,全自动喷淋式高温高压调理杀菌锅,电脑全自动水浴式串联杀菌锅,2)使用方法 加水至锅内达规定的水平面，放人欲灭菌物品，把锅盖按对称的螺旋先后对称用力（切勿单个依次）扭紧，使锅盖确实均匀密闭。 用电炉加热，同时打开排气阀门，使器内冷空气逸出，保证器内温度和压力表所示一致。待空气全部排出后，关闭排气阀。 继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字（例如15磅）即调节热源，维持2030min可完全杀死细菌的繁殖体和芽胞。 灭菌时间到达后，停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。,3)注意事项 检查排气活塞及安全