醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点

醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何 优缺点 优缺点 标签 标签 基础知识基础知识 提问者 游客 浏览次数 246 提问时间 2008 09 07 01 38 姓名 笔名 等级 回答数 0 次 通过率 0 主营行业 公司 答案答案 收藏答案 收藏答案 分享给好友 最新回答者 mayibanjia110 等级 列兵 一级 回答的其他贡献者 mayibanj 醋酸纤维素薄膜电泳的特点 醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的 醋酸纤维素薄膜作为是电泳 支持体 它有以下优点 电泳后区带界限清晰 通电时间较短 二十分钟至一小时 它对各种蛋白质 包括血清白蛋白 溶菌酶及核糖核酸酶 都几乎完全 不吸附 因此无拖尾现象 对染料也没有吸附 因此不结合的染料能完全洗掉 无样品处几乎完全 无色 它的电渗作用虽高但很均一 不影响样品的分离效果 由于醋酸纤维素 薄膜吸水量较低 因此必需在密闭的容器中进行电泳 并使用较低有电流避免 蒸发 醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白 血红蛋白 球蛋白 脂蛋白 糖蛋 白 甲胎蛋白 类固醇及同工酶等的分离分析中 尽管它的分辨力比聚丙 酰胺凝胶电泳低 但它具有简单 快速等优点 根据样品理化性质 从提高电 泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类 pH 和离子强度 选择好的缓冲液最好 是挥发性强 对显色或紫外光等观察区带没有影响 若样品含盐量较高时 宜 采用含盐缓冲液 例如血清蛋白电泳可选用 pH8 6 的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲 液 氨基酸的分离则可选用 pH7 2 的磷酸盐缓冲液等 电泳时先将滤膜剪成一 定长度和宽度的纸条 在欲点样的位置用铅笔做上记号 点上样品 在一定的 电压 电流下电泳一定时间 取下滤膜 进行染色 不同物质需采用不同的显 色方法 如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位 但许多物质必须经染色 剂显色 醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下 溶于一定的溶剂中进行光密度测 定 也可以浸于折射率为 1 474 的油中或其他透明液中使之透明 然后直接用 光密度计测定 它的缺点是厚度小 样品用量很小 不适于制备 原理 醋酸纤维素薄膜电泳 cellulose acetate membrance electrophoresis 以醋酸纤维薄膜为支持物 它是纤维素的醋酸酯 由纤维素的羟基经乙酰化而 制成 它溶于丙酮等有机溶液中 即可涂布成均一细密的微孔薄膜 厚度以 0 1mm 0 15mm 为宜 太厚吸水性差 分离效果不好 太薄则膜片缺少应有的机 械强度则易碎 醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较 有以下优点 1 醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少 无 拖尾 现象 染色后背景 能完全脱色 各种蛋白质染色带分离清晰 因而提高了测定的精确性 2 快速省时 由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小 薄膜中所容纳的缓 冲液也较少 电渗作用小 电泳时大部分电流是由样品传导的 所以分离速度 快 电泳时间短 一般电泳 45 60min 即可 加上染色 脱色 整个电泳完成仅 需 90min 左右 3 灵敏度高 样品用量少 血清蛋白仅需 2 l 血清 甚至加样体积少 至 0 1 l 仅含 5 g 蛋白样品也可得到清晰的分离带 临床医学检验利用这 一点 检测在病理情况下微量异常蛋白的改变 4 应用面广 某些蛋白在纸上电泳不易分离 如胎儿甲种球蛋白 溶菌 酶 胰岛素 组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离 5 醋酸纤维素薄膜电泳染色后 经冰乙酸 乙醇混合液或其它溶液浸泡 后可制成透明的干板 有利于扫描定量及长期保存 2 醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比 操作简单 但分离效 果不太好 如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中 只能分离出 5 6 条区带 而 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数 10 条区带 应用意义 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单 快速 廉价 目前已广泛用于检测血 浆蛋白 脂蛋白 糖蛋白 胎儿甲种球蛋白 体液 脊髓液 脱氢酶 多肽 核酸及其他生物大分子 为心血管疾病 肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可 靠的依据 因而成为医学和临床检验的常规技术 注意事项 1 醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片 薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关 键之一 将干膜片漂浮于电极缓冲液表面 其目的是选择膜片厚薄及均匀度 如漂浮 15s 30s 时 膜片吸水不均匀 则有白斑点或条纹 这提示膜片厚薄不 匀 应舍去不用 以免造成电泳后区带扭曲 界线不清 背景脱色困难 结果 难以重复 由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小 浸泡 30min 以上是保证膜片上有 一定量的缓冲液 并使其恢复到原来多孔的网状结构 最好是让漂浮于缓冲液 的薄膜吸满缓冲液后自然下沉 这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走 点样时 应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去 以免缓冲液太多引起样品扩散 但也 不能吸得太干 太干则样品不易进入薄膜的网孔内 而造成电泳起始点参差不 齐 影响分离效果 吸水量以不干不湿为宜 为防止指纹感染 取膜时 应戴 指套或用镊子 2 缓冲液的选择 醋酸纤维素薄膜电泳常选用 pH8 6 巴比妥溶液 其浓度为 0 05mol L 0 09mol L 选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关 选择时 先初步定下某一 浓度 如电泳槽两极之间的膜长度为 8 cm 10cm 则需电压 25V cm 膜长 电流 强度为 0 4mA cm 0 5mA cm 膜宽 当电泳达不到或超过这个值时 则应增加缓 冲液浓度或进行稀释 缓冲液浓度过低 则区带泳动速度快 并由于扩散变宽 缓冲液浓度过高 则区带泳动速度慢 区带分布过于集中不易分辨 3 加样量 加样品的多少与电泳条件 样品的性质 染色方法与检测手段灵敏度密切 相关 作为一般原则 检测方法越灵敏 加样量则越少 对分离更有利 如加 样量过大 则电泳后区带分离不清楚 甚至互相干扰 染色也较费时 如电泳 后用洗脱法定量时 每厘米加样线上需加样品 0 1 l 0 5 l 约相当于 5 g 1000 g 蛋白 血清蛋白常规电泳分离时 每厘米加样线加样量不超过 1 l 相当于 60 g 80 g 的蛋白质 但糖蛋白和脂蛋白电泳时 加样量则应多些 对每种样品加样量均应先作预实验加以选择 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一 以印章法加样时 动作应轻 稳 用力不能太重 以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果 4 电量的选择 电泳过程应选择合适的电流强度 一般电流强度为 0 4mA cm 0 5mA cm 宽 膜为宜 电流强度高 尤其在温度较高的环境中 可引起蛋白质变性或由于热 效应引起缓冲液中水分蒸发 使缓冲液浓度增加 造成膜片干涸 电流过低 则样品泳动速度慢且易扩散 5 染色液的选择 对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择 其原则是染料 对被分离样品有较强的着色力 背景易脱色 应尽量采用水溶性染料 不宜选 择醇溶性染料 以免引起醋酸纤维素膜溶解 应控制染色时间 时间长 薄膜底色深不易脱去 时间短 着色浅不宜区 分 或造成条带染色不均