抗肿瘤药效学指导原则

抗肿瘤药物药效学指导原则抗肿瘤药物药效学指导原则 讨论稿 1 基本原则基本原则 抗肿瘤药物可分为 1 细胞毒类药物 cytotoxic agent 包括干扰核酸和蛋 白质合成 抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等 2 生物反应调节剂 biological response modifier 3 肿瘤耐药逆转剂 resistance reversal agent 4 肿瘤治疗增敏剂 oncotherapy sensitizer 5 肿瘤血管生成抑制剂 tumor angiogenesis inhibitor 6 分化诱导剂 differentiation inducing agent 7 生长因 子抑制剂 growth factor inhibitor 8 反义寡核苷酸 antisense oligonucleotide 等 抗肿瘤药物的药效学包括体内外抗肿瘤试验 评价药物的抗癌活性时 以体内 试验结果为主 同时参考体外试验结果以做出正确的结论 I 类抗肿瘤新药应进 行药物作用机制的初步研究 2 体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验 2 1 试验目的 1 对候选化合物进行初步筛选 2 了解候选化合物的抗瘤谱 3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考 如剂量范围 肿瘤类别等 2 2 试验方法 选用 10 15 株人癌细胞株 根据试验目的和所选用的方法选择 相应的细胞系及适量的细胞接种浓度 按常规细胞培养法进行培养 推荐使用 四氮唑盐 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 2 5 diphenyl tetrazolium bromide MTT 还原 法 XTT 2 3 bis 2 methoxy 4 nitro 5 sulphonyl 5 carboxanilide 2H tetrazolium hydroxide 还原法 磺酰罗丹明 B sulforhodamine B SRB 染色法 或 51Cr 释放 试验 集落形成法等测定药物的抗癌作用 药物与细胞共培养的时间一般为 48 72 小时 贴壁细胞需先贴壁 24 小时后再给药 试验应设阳性及阴性对照组 阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药 阴性对照为溶媒对照 2 3 评价标准 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应 曲线 然后采用 Logit 法计算半数有效浓度 IC50值或 EC50 值 体外试验至少 重复一次 3 体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验结果是评价候选抗肿瘤化合物有效性的最重要指标 体内 抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 其中至少一种为人癌裸小鼠移植瘤模 型或其它人癌小鼠模型 试验结果三种模型均为有效 再重复一次也为有效 评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用 鼓励使用人癌裸小鼠移植瘤模 型和多种类的移植瘤模型 以较正确和全面地评价候选化合物的抗瘤活性和抗 瘤谱 鼓励使用原位接种模型和中空纤维测定 hollow fiber assay 等先进的抗肿 瘤作用评价方法 3 1 动物 动物要求健康 符合等级动物要求 有实验动物合格证 雌雄均可 但同一批实验中动物性别必须相同 小鼠鼠龄为 5 6 周 体重为 18 22 克 评 价同一物质的活性时 不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠 3 2 肿瘤模型 3 2 1 小鼠肿瘤模型 可应用的小鼠肿瘤模型包括淋巴细胞白血病腹水瘤 L1210 和 P388 白血病 L 615 宫颈癌 U14 肝癌 H22 Lewis 肺癌 黑色素瘤 B16 网织细胞瘤 M5076 肠癌 26 肠腺癌 38 乳腺癌 CD8F1 艾氏腹水瘤 EAC 肉瘤 180 等 以及以上各种小鼠肿瘤的亚型和耐药瘤等 3 2 2 人癌裸小鼠移植瘤模型 应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌移 植瘤试验 模型的建立和使用请注意以下几点 1 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立 对细胞株和移植瘤的化疗敏 感性应予了解 2 移植瘤复苏后一般应传 2 3 代后再用于体内抗肿瘤试验 3 对模型生长情况应全面了解 尤其是生长快的模型 4 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性 复苏后移植瘤体内传代应 少 15 20 代 3 3 试验过程 3 3 1 接种 肿瘤接种方法主要有皮下接种 腹腔接种和原位接种 皮下瘤模型 选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠 颈椎脱臼处死 在无菌条件下 超净台或接种罩 用碘酒 酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤 切 开皮肤 剥离肿瘤 将瘤组织剪成 1 5 mm3左右 用套管针接种于动物一侧或 双侧腋窝皮下 或制成细胞悬液 然后按一定比例加入无菌生理盐水 一般每 只小鼠接种肿瘤细胞数量为 1 5 106 腹水瘤模型 无菌条件下 消毒动物皮肤 吸取生长良好的动物腹水 以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔 接种细胞数量一般为 1 5 106 原位接种模型 原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某 脏器 如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏 原位接种不是常规的方法 但有其优 越性 是鼓励使用的方法 主要有肺 肝 胃 肠 乳腺 颅内等原位接种方 法 3 3 2 分组和剂量设置 分组 试验分阴性对照组 阳性对照组 治疗组 治疗组设高 中 低三个剂量组 小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组 裸小鼠移植瘤 用游标卡尺测量移植瘤直径 待肿瘤生长至 100 300mm3后将动物随机分组 治疗组动物数普通小鼠每组至少 10 只 裸小鼠至少 6 只 阴性对照组动物数为 治疗组动物数 试验组数 剂量设置 治疗组设高 中 低剂量治疗组 一般按 4 2 1 设置 高剂 量使用最大耐受量或 LD10的剂量 阴性对照组给予相应的溶剂 阳性对照药选 用对该动物敏感的 临床应用的抗肿瘤药物 如试验化合物为一抗癌药物的衍 生物或类似物时 必须选用该抗癌药物作为阳性对照药 阳性对照药选择原则 为 1 疗效确切 2 与被试物质化学结构类似 3 与被试物质有类似 的作用机理 3 3 3 药物配制 给药时间和给药途径 药物配制 溶于水的药物 用生理盐水或蒸馏水配制 如用酸 碱溶 解者 可先用小量酸 0 1 0 5N HCl 或碱 NaHCO3 Na2CO3 NaOH 溶解 调节 pH 在 4 5 9 0 的范围内 用乙醇 丙二醇 吐温 80 DMSO 助溶的药物 或用 吐温 60 吐温 80 2 3 淀粉 0 5 羧甲基纤维素制成混悬液的药物 可腹腔 注射或口服 但必须设相同浓度的溶剂对照组 用注射用花生油配制的溶液或 乳剂可口服 皮下或肌肉注射 给药时间和给药途径 分组当日开始给药 根据不同药物的代谢动力 学和毒性反应等确定给药方案 给药途径应与推荐临床用药的途径相同 静脉 给药和口服给药是较为理想的给药途径 给药次数较多 或被试物质溶解性较 差 静脉给药有困难时 可考虑使用腹腔给药 但在评价药效时要注意这两种 给药途径是有差别的 特殊情况下根据药物作用特点和推荐临床给药方法可采 取瘤周 瘤内 肌肉 皮下给药途径 腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途 径 不可采用从饮水中给药的方式 3 4 评价标准 3 4 1 腹水瘤模型 接种给药后 观察和记录动物死亡时间 计算生存天数 如阴性对照组 20 动 物存活时间超过 4 周 表明腹水瘤生长不良 实验作废 采用中位生存时间 即 median survival time MST 来评价每组生存时间 其计算公式为 每组鼠数的中间数 中间生存天数前 死亡的鼠数 MST 中间生存天数 0 5 中间生存天数死亡的鼠数 治疗组与对照组的比较 采用 T C 来表示 计算公式为 TMST T C 100 CMST TMST 治疗组 MST CMST 阴性对照组 MST 评价的标准则以 125 为界 当 T C 125 时 视为有效 反之则无效 报告格式见表 1 表 1 XXX 对腹水瘤 XXX 的实验治疗作用 组别 剂量 给药 动物数 开始体重 克 中位生存时间 T C 方式 只 x SD 天 阴性对照 阳性对照 治疗组 高剂量 中剂量 低剂量 3 4 2 裸小鼠移植瘤模型 推荐使用测量瘤径的方法 动态观察被试物抗肿瘤的效应 肿瘤直径的测 量次数根据移植瘤的生长情况而定 一般为每周 2 3 次 每次测量同时还需称鼠 重 肿瘤体积 tumor volume TV 的计算公式为 V 1 2 a b2 或 6 a b c 其中 a b c 分别表示长宽高 由于此两公式的相关性极好 可采用任一 公式 根据测量的结果计算出相对肿瘤体积 relative tumor volume RTV 计 算公式为 RTV Vt V0 其中 V0为分笼给药时 即 d0 测量所得肿瘤体积 Vt 为每一次测量时的肿瘤体积 抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率 T C 计算公式如下 TRTV T C 100 CRTV TRTV 治疗组 RTV CRTV 阴性对照组 RTV 疗效评价标准 T C 60 为无效 T C 60 并经统计学处理 P 0 05 为有效 报告格式见图 1 和表 2 并应提供相应照片 表 2 XXX 对人癌裸小鼠移植瘤 XXX 的实验治疗作用 组别 剂量 给药 动物数 平均体重 克 TV x SD RTV T C P 值 方式 d0 dn d0 dn d0 dn x SD 阴性对照 阳性对照 治疗组 高剂量 中剂量 低剂量 d0 分笼给药时间 dn 实际治疗疗效最佳的时间 注 图中为示意曲线 图 1 XXX 对人癌裸小鼠移植瘤 XXX 的生长抑制作用 3 4 3 小鼠肿瘤模型 生长较慢的小鼠肿瘤采用与裸小鼠移植瘤同样的量瘤径的评价方法 生长较快的小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价 试验结束后处死动物 称体重 解剖剥离瘤块 称瘤重 阴性对照组肿瘤平均瘤重小于 1 克 或 20 肿瘤重量 小于 400 毫克 表示肿瘤生长不良 试验作废 疗效评价公式 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 1 6 0361013172024 时间 天 移植瘤体积 cm3 阴性对照 阳性对照 高剂量 中剂量 低剂量 给药组平均瘤重 阴性对照组 平均瘤重 肿瘤生长抑制率 100 阴性 对照组平均瘤重 评价标准 肿瘤生长抑制率 40 为无效 肿瘤生长抑制率 40 并经统 计学处理 P50 细胞形态学观察 可在光学显微镜与电镜下观察候选化合物作用后细胞的 形态学变化 对照组的早幼粒细胞应 90 95 候选化合物组细胞分化 成熟 粒细胞占比例越高 说明该化合物的分化效果越好 吞噬功能测定 对照组吞噬阳性细胞50 实体瘤的分化诱导 常用细胞株 试验方法及评价标准如下 人肝癌 HepG2 SMMC7721 细胞分化诱导试验 主要测定细胞的 甲胎蛋白 AFP 白蛋白含量 谷氨酸转移酶 Glutmyl transferase GT 酪氨酸转氨酶 tyrosine alpha ketoglutarate transaminase TAT 活性及观察细胞 形态 分化细胞的 AFP 含量 TAT 和 GT 活性明显降低 白蛋白含量增加 细胞胞质增加 核缩小 人结肠癌 HT 29 细胞分化诱导试验 该细胞可被分化为成熟的腺细胞 主要检测细胞粘液分泌 计算粘液分泌细胞百分率 测定其碱性磷酸酶活性 并观察形态变化 分化细胞形成平坦状 如粘液分泌细胞 50 碱性磷酸酶活 性增加 100 则该候选化合物有效 小鼠黑色素瘤 B16 细胞分化诱导试验 一般进行细胞的黑色素含量 酪 氨酸酶活力测定和形态观察 有效的候选化合物可使细胞体积变大 多数细胞 有树突状 dendrite 结构 黑色素含量增加 2 倍以上 酪氨酸酶活力增加 1 倍 以上 4 5 2 体内试验 常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验 小鼠髓单核细胞白血 病试验和人癌细胞裸小鼠移植瘤模型等 可选两种模型 根据肿瘤鼠生存时间 肿瘤的体积及形态变化 从整体水平观察分化诱导效果 重复试验一次 4 6 肿瘤治疗增敏剂 肿瘤治疗增敏剂主要是指放射治疗增敏剂 能增加临床上恶性肿瘤放射治 疗或其它治疗的疗效及降低治疗后的复发率 其药效学试验分为体外和体内试 验 4 6 1 体外试验 分别选择对放射 化疗药物具有中 低度敏感的人肿瘤细胞 株 采用 MTT SRB 或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验 以 IC50 值作为评价指标 多细胞球体 multicell spheroids 培养实验技术在研究增敏 作用 以及这些化合物的扩散和对乏氧细胞或休止期细胞的作用方面很有价值 可应用离体培养细胞的乏氧照射技术制作乏氧模型 评价增敏效果 氧增比 Oxygen enhancement ratio OER 可反映乏氧模型模拟肿瘤的缺氧情况 OER 值达 2 5 3 0 即符合乏氧要求 乏氧条件下不给药组细胞存活曲线的 DO值 OER 有氧条件下不给药组细胞存活曲线的 DO值 DO值是杀伤 63 细胞所需的 浓度 增敏比 Sensitivity enhancement ratio SER 及 C1 6作为评价被试药物增 敏效果的指标 乏氧条件下对照组的 DO值 SER 乏氧条件下给药组的 DO值 C1 6即 SER 1 6 时所需的药物浓度 C1 6 mmol L 的值越小 表明药物 的增效作用就越强 一般 C1 6 1 4 认为有明显的增效作用 4 6 2 体内试验 选用对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试 验 其中至少有一种是人癌裸小鼠移植瘤模型 放射治疗增敏剂的试验中一般 用低 LET X 或 射线照射 也可用高 LET 中子 质子 照射 由强致癌物或病 毒等因素诱发的肿瘤 或者不是在同一品系动物身上移植传代的肿瘤往往会出 现免疫反应 因此都不能用于肿瘤治疗增敏剂的研究 疗效评价除参照本章 体内抗肿瘤试验 部分 尚可观察 1 50 肿瘤控制剂量 TCD50 即 50 荷瘤 动物的肿瘤得到控制或治愈所需的照射剂量 2 半数有效剂量 ED50 对 50 的动物有效的照射剂量 能使肿瘤的生长被抑制 60 以上视为有效 3 生长延缓 growth delay 天数 即肿瘤受照后从一个特定大小 A 生长到某一特定 大小 B 所需的时间 Tx 然后与对照组 Tc 相比较 Tx Tc为有效 4 增敏比 SER 照射对照组 DO值 给药组 DO值 还应观察被试药物对正常组织是否也有 影响 可进行治疗增益系数 Therapentic Gain Factor TGF TGF 指某种因子 引起肿瘤组织细胞的损伤与正常组织细胞的损伤之比 即 TGF 肿瘤组织 SER 正常组织 SER 参参 考考 文文 献献 1 DeGeorge JJ et al Regulatory considerations for preclinical development of anticancer drugs Cancer Chemother Pharmacol 1998 41 173 85 2 Page M et al In vitro methods In Teicher BA eds Anticancer drug development guide preclinical screening clinical trials and approval Humana Press Inc Totowa NJ 1997 3 56 3 Boyd MR Some practical considerations and applications of the National Cancer Institute in vitro anticancer drug discovery screen Drug Develop Res 1995 34 91 109 4 Waud WR et al In vivo methods Teicher BA eds Anticancer drug development guide preclinical screening clinical trials and approval Humana Press Inc Totowa NJ 1997 59 213 5 Hollingshead MG et al In vivo cultivation of tumor cells in hollow fibers Life Sci 1995 57 131 141 6 Berger DP et al Establishment and characterization of human tumor xenografts in thymus aplastic nude mice In Feibig HH BergerDP Eds Immunodeficent Mice in Oncology Basel Karger 1992 42 23 46 7 Maruo M Method of tumor transplantation In K Nomura T Sakurai Y and Inaba M The Nude Mouse and Anticancer Drug Evaluation Japan 1996 205 214 8 Luk GD et al Sucessful treatment with DL a difluoromethylornithine in established human small cell variant lung carcinoma implants in athymic mice Cancer Res 1983 43 4239 9 Guilband N et al In vivo antitumor activity of S16020 2 a new olivancine derivative Cancer Chemother Pharmacol 1996 38 513 521 10 Stearns ME et al Interleukin 10 IL 10 inhibition of primary human prostate cell induced angiogenesis IL 10 stimulation of tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and inhibition of matrix metalloproteinase MMP 2 MMP 9 secretion Clin Cancer Res 1999 5 189 96 11 Volm M Multidrug resistance and its reversal Anticancer Res 1998 18 2905 18 12 Bergamo A et al In vitro cell cycle arrest in vivo action on solid metastasizing tumors and host toxicity of the antimetastatic drug NAMI A an