心脏疾病的实验诊断

心脏疾病的实验诊断,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,冠心病概念的发展,50年代 心绞痛 心肌梗死 80年代 无Q波心肌梗死(心内膜下心梗) Q波心肌梗死(穿壁性心梗)90年代 不稳定性心绞痛 稳定性心绞痛 2000年 急性冠脉综合症(ACS),稳定性心绞痛(stable angina pectoris) 在六十天内，胸痛发作的强度，频率，持续时间等特征未发生改变，口服硝酸甘油能缓解，疼痛无放射性，持续约四分钟，休息能缓解。伴有心肌功能障碍，无心肌坏死,不稳定性心绞痛(unstable angina pectoris, UAP) 在六十天内疼痛的频率，强度均发生改变，疼痛时间延长，频率增加，疼痛加重，具放射性，口服硝酸甘油作用减小,急性冠状动脉综合征,一般认为，急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是包括不稳定性心绞痛（UAP）、无Q波心肌梗死（NQMI）和Q波心肌梗死（QwMI）的一组病症。,近来，许多文献资料和随机对照实验中也将Q波心肌梗死称为ST段抬高的心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI），而将无Q波心肌梗死称为ST段不抬高的心肌梗死（non-ST-segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）。,急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）,临床病理生理 动脉粥样斑块脱落、血小板聚集、血栓形成、心肌缺血、心肌坏死 等等临床表现 症状不明显的隐性心绞痛、不稳定心绞痛、急性心肌梗死（AMI）、甚至心律失常导致死亡,ACS的主要病因,急性血栓脱落进行性的冠脉梗塞炎症继发性不稳定心绞痛冠状动脉血管痉挛,AMI流行病学调查,在美国每年有150万心肌梗死病人：其中1/3在1年内死亡只有50%的患者被送到医院就诊，其中5%因为诊断的假阴性结果被不合适地送回家另一方面，大约有200万到心脏病重症治疗单位(CICU)就诊的患者疑有AMI，但其中只有3050%的患者被确认为AMI这些患者的治疗费用：$40亿/年,心血管病死亡率统计,全球：20世纪初，仅占总死亡率10以下 21世纪初，发达国家占总死亡率近 50 发展中国家占总死亡率 25中国：已成为常见疾病和主要死亡原因之一。1999，城市为236.08/10万（38.45%) 农村为186.56/10万（30.77%)2003, 城市:181.63/10万 （34.38%) 农村:135.53/10万 （35.78%) 每年约有300万人死于心血管病,心肌标志物发展史,上世纪50年代前，医生依据临床症状、心电图变化诊断MI实验室无任何检验有助于诊断心肌梗死（MI）保守治疗,从1954年开始，实验室发现测定AST（G0T）有助于MI诊断60年开始测定总CK70年代CK-MB达到高峰,当时曾将CK-MB定为诊断AMI”Gold Standard”90年代开始,酶学时代巳结束,酶学标志物（50-80年代）,早期标志物： CK（肌酸激酶） CK-MB（isoenzyme,isozyme） CK-MB亚型（isoform,isotype）晚期标志物 LD，LD1，HBDH（实际为LD1）AST测定无何实际临床价值,WH0诊断MI标准,典型的胸痛病史；ECG异常改变，出现Q波或QS波，持续1天以上；酶测定值的持续异常或先升高后降低 至少应符合其中两条方可诊断为AMI,蛋白标志物（90年代-）,90年代心脏结构蛋白(肌钙蛋白,肌红蛋白等)取代酶成为灵敏度,特异性更高的心脏标志物早期标志物 肌红蛋白，CK-MB亚型确认标志物 心脏特异肌钙蛋白（cTn） CK-MB（mass）,肌细胞中的蛋白质,胞浆游离蛋白：肌红蛋白CKLDH6%TNT2%TNI1%肌球蛋白,细胞结合蛋白：TNTTNITNC肌球蛋白,Panteghini, M. Chest 2002;122:1428-1435,Time course of release of cardiac proteins in blood after AMI,教科书 VS. 现实,男性65 岁以上胸痛胸骨下放射性疼痛心绞痛历史,33% 为女性3550% 在65岁以下1125% 没有胸痛症状35% 胸痛症状不典型50% 没有心绞痛历史,决定心肌标志物特点的因素, 分子大小 细胞内分布 释放率 清除率（或半衰期） 心肌特异性 等等,理想心肌标志物的条件, 高度心脏专一性 心肌损伤后很快增高 增高后持续较长时间 容易检测 很快得到检测结果（1 h） 诊断价值已经临床证实,心肌损伤部分早期标志物,标志物名称 MW 半衰期(h) 临界值(L) 增高(h) 高峰(h) 回复(d) C反应蛋白（CRP） 120 00019 3mg 6 1224 23淀粉样蛋白A 12 000 3mg 6 1224 23血栓前体蛋白(Tp P) 300 000 4mg 6 1224 3P-选择素(p-selectin) 140 000 1 200mg 1 5 1可溶性纤维蛋白糖原磷酸化酶BB 188 000 46 7mg 24 1224 12脂肪酸结合蛋白 15 000 14 19mg 26 612 1肌球蛋白轻链(MLC) 27 000 1.25 1mg 36 96 10a-肌动蛋白(a-actin) 43 000 1 7肌红蛋白（Myo） 17 500 0.25 80mg 26 612 1碳酸酐酶III(CA III) 280 000 24mg 2CK-MB 86 000 1216 5mg 610 1224 23,心肌梗死诊断的实验室指标的特性,实验室 分子量 生理半衰期 升高时间 峰值时间 恢复正常时间 指标 (KD) (h) (h) (h) (d)AST 93 20 612 1836 34 LDH-1 135 110 612 48144 714CK 86 17 312 1224 34CK-MB活性 86 13 312 1224 23CK-MB质量 86 13 26 1224 3Myoglobin 17.8 0.25 0.52 6 12 1cTnI 22.5 24 38 1224 710 cTnT 37 24 38 1296 714GP-BB 188 46 14 1020 12H-FABP 15 0.3 25 612 1 ,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白在MI发生后最早升高,和CK-MB亚型(isoform,isotype)同列为早期标记物.缺点为特异性差,虽灵敏度很高.与横纹肌Mb有交叉，要排除：剧烈运动、骨骼肌病或损伤；由于从肾脏代谢清除，要排除休克和肾衰。,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白（Myo） MW 17.8 kDa 153 个氨基酸的多肽和血红素辅基组成 占横纹肌蛋白 2%，主要位于胞浆 结构与 Hb 相似，为携氧载体 1975年首先报道 AMI 时增高,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白（Myo） MI 后能迅速从坏死心肌中释放，具有高度的敏感性，但心肌特异性不高 阴性特别有助于排除 AMI 的诊断 有助于观察 AMI 病程中有无再梗死发生以及梗死有无扩展 AMI 后的溶栓治疗中评价有无再灌注时较敏感而准确的指标,心肌损伤早期标志物,迄今为止受到公认的早期生化标志物主要限于肌红蛋白；CRP 的应用近年来也不断受到关注；其余各标志物由于不同报道或不同方法的测定值变异较大，其临床使用价值目前尚有限,心肌损伤确定标志物,肌酸激酶 MB 同工酶（CK-MB） 分析测定有多种方法 测定其活性（U/L）的常用方法 CK-MB 质量(CK-MB mass) 测定避免了可能的干扰，具有高度的灵敏性 (最低检测限 1 mg/L) 和准确性，测定时间短 (最快仅需 7 min)，适合于自动化分析,Creatine Kinase（CK, EC 2.7.3.2， ATP:肌酸磷酸转移酶）pH9.0ATP + 肌酸 磷酸肌酸 + ADP pH7.0 CK: MM, MB, BB, Mt MW 86 000,肌酸激酶同工酶,组 织 CK U/克湿重 CK-MM % CK-MB% CK-BB%骨胳肌 3280 99 1 0(腓肠肌)骨胳肌 1894 99 1 1(肋间肌) 心肌 620 87 13 0(乳头状肌)心肌 402 7678 22 02(右心房)脑 200 0 0 100回肠 161 3 1 96结肠 137 34 625%,CK-MB mass 的免疫测定（示意图）,CK-MB mass 免疫分析测定的部分特点*,CK-MM亚型: MM3基因型、组织型 M2M2 MM2 -Lys M1M2 MM1 -2 Lys M1M1 CK-MB亚型: CK-MB1 -2Lys, CK-MB2（组织型）,CK-同工酶亚型,CK-MM亚型电泳法测定原理,在电泳缓冲液中加入Polybuffer, 通电后形成一pH梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至阴极依次为CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3。然后以常规CK同工酶电泳法原理进一步定量。,乳酸脱氢酶同工酶,Lactate Dehydrogenase, LDH, LD, EC 1.1.1.27 L-乳酸:NAD氧化还原酶 pH89.8 乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ pH7.47.8 LDH 15 H, M, MW 140,000. LDH 1,2: 心肌, 肾, 红细胞 LDH 3: 肺, 脾, 胰, 甲状腺, 肾上腺, 淋巴结 LDH 4,5: 骨骼肌, 肝 LDH x: 睾丸, 精子,AMI: 总LDH: 1218h3d714d LDH1: 6h24h LDH1/LDH2=1 24h 轻症: 总LDH正常, 同工酶有变化 同时有心衰、心源性休克, LDH5% 总LDH: 敏感性 95.8%, 特异性 89.3% LDH1: 敏感性 86%, 特异性 91.3% LDH1/LDH2: 敏感性 91.6%, 特异性 92.7%,LDH同工酶临床评价,肌钙蛋白（troponin）,1965年 Ebashi 和 Kodama 首先发现，随后被命名1968年 Hartshorne 和 Mueller 认为是一复合物，并研究了功能1971年 Ebashi 等纯化后用 SDS 电泳分析，得到三个片段1973年 Greaser 和 Gergely 根据其功能，将三个亚基命名为 TnC，TnI，TnT,心肌细丝结构蛋白,肌动蛋白（acting） MW 42 000 聚合成长链（F-acting） 两条盘绕，双股螺旋结构原肌球蛋白（tropomyosin） MW 70 000 调节蛋白 位于 F-acting 双股螺旋沟中肌钙蛋白（troponin）,肌肉细丝中的肌钙蛋白位置（示意图）,肌钙蛋白的作用机制,A:示一肌节，以肌球蛋白为主的粗丝和肌动蛋白为主的细丝的相对位置，在肌肉收缩时，在ATP提供能量和细胞内钙离子作用下，肌丝间沿纵轴滑动，肌节缩短。B:在无钙离子时，肌纤维松弛状态时，肌钙蛋白原肌球蛋白肌动蛋白互相作用模式。C:钙离子进入并和肌钙蛋白结合，导致肌钙蛋白复合物构象改变。,肌钙蛋白（ troponin）,肌钙蛋白基因位于染色体的位置,cTn I 或 cTn T 的部分特性,cTn亚基 主要作用 分子量(kDa) 等电点 TnC Ca2+结合亚基 18 4.1 cTn I 抑制亚基 23 9.87 cTn T 结合亚基 34 5.1 cTn I 相对于两种 sTn I 有 40% 不同源性 人 cTn I 氨基末端比 sTn I 多 31 个氨基酸,cTn I 或 cTn T 的部分特性,外周血中的 cTn,心肌损伤后 68 h 后即可在外周血测得增高持续 710天（cTn I） 或1014天（cTn T）cTn 的释放以 TnC-cTnI-cTnT 复合物形式，随后降解；外周血中的 cTnI 以 cTnI-TnC复合物形式居多数（90%以上），游离的 cTn I 较少；cTn T 游离形式较多,cTn 的检测,cTn 可以用高度敏感的标记免疫法作定量检测，也可用固相免疫层析法作快速定量或定性检测外周血中出现任何一种可检测到的 cTn 必然是心肌细胞受损伤的结果,cTn I 的检测,1987年报道检测方法（放免法） 目前检测 cTn I 的试剂、方法很多，并得到广泛应用 各种 cTn I 分析方法测定结果之间差异很大，最大可相差 36 倍,几种自动免疫分析仪测定 cTn 的性能,cTn I 的检测 (抗体),各种检测方法采用不同的抗体；各种抗体针对不同的抗原决定簇cTn I 分子内的不同片段和不同抗原决定簇受氧化-还原反应、磷酸化反应或蛋白水解酶作用等而降解的影响各不相同不同形式（游离或复合物形式）的 cTn I对不同抗体的免疫反应性也各不相同,cTn 检测在ACS中的临床意义,确定诊断危险性分类估计病情治疗指导,cTn 在临床诊断中的用途,诊断 主要用于心肌缺血损伤如 ACS（包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛以及急性心肌梗死）等的临床诊断预后估计 急性冠状动脉综合征危险性估计 cTn 是早期危险性分类的较好指标 急性冠状动脉综合征预后判断 cTn 增高程度与预后有关,cTn 在临床诊断中的用途,心肌缺血损伤面积的估计临床诊断心肌炎临床诊断心肌创伤（心脏手术）围手术期心脏并发症严重脓毒血症或脓毒血症导致的左心衰竭,cTn 在临床诊断中的用途,充血性心功能不全某些治疗药物的临床疗效观察 等等,cTn 在临床诊断中的用途,MI 后的溶栓治疗（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）效果判定 TIMI 的疗效分级 血样本采集时间（60 min；90 min； 120 min） 至少两次：治疗开始时（T0） 治疗开始后 90 min（T90）,cTn 在临床诊断中的用途,不稳定心绞痛患者cTnT水平与预后危险性,危险分层是cTn的重要应用,医师对急诊疑似ACS病人,首先要进行危险分层,必须根据入院时病史,症状,物理检查,ECG和心脏标志物检查结果判断病人有无危险有无猝死,或其它非致死性心脏事件的可能性,危险分层用于,下述患者:不稳定心绞痛无ST升高的ACS病人预测下述问题:死亡危险性续发AMI需要血管成形术的可能性,危险分层的基本原则,确定危险分层以:选择治疗场所 心脏监护病房,急诊或者门诊选择最合适的治疗干预措施 积极的手术治疗到消极的保守治疗判断预后,根据TnI和ECG危险分层,TnI比ECG更能说明病人危险性,IFCC 和 NACB 的专家建议：,（ X ）指选择性检测,1临床应用应考虑各自的诊断“窗口期”；注意选择合适的标本采集时间疑为急性心肌损伤时标本采集建议,心肌损伤标记物及其检测时间,注：cTnT，心脏肌钙蛋白T；cTnI，心脏肌钙蛋白I；CK-MB，肌酸激酶同功酶肌酸激酶同工酶（CK-MB）迄今一直是评估ACS的主要血清心肌损伤标记物。,IFCC 和 NACB 的专家建议：,2各实验室应用 cTn 应根据 ROC 曲线选定合适的临界值3不同的 cTn I 检测系统有不同的临界值；对不同检测系统应根据检测条件建立适当的各实验室的参考范围；参考范围上限应选取第 97.5 百分位点（单向）,IFCC 和 NACB 的专家建议：,4低临界值的测定不精密性应10%5应设法使检测周转时间（TAT）控制在1 h 之内等等TAT: Turnaround time,心肌标志物的检测 TAT,AMI后 6 小时,胸痛6 小时,肌钙蛋白,阴性,阳性,AMI,15 min,15 min,15 min,15 min,不稳定心绞痛/AMI,危险性较低其它疾病?,+4 hr,危险性较低其它疾病?,不稳定心绞痛/AMI,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,利钠肽（natriuretic peptide）,1956年，Kisch 和 Henry 分别证实心脏具有内分泌功能1981年，de Bold 发现 atrial natriuretic peptide（A-type natriuretic peptide，ANP）1988年，Sudoh 报道了 brain natriuretic peptide （B-type natriuretic peptide，BNP）1990年，Sudoh 又发现了C-type natriuretic peptide（CNP）,心脏利钠肽的释放,刺激 ANP 和 BNP 释放的主要因素是心肌张力的增加ANP 的分泌释放调节主要在心房储存水平，新合成的较少BNP 的合成、分泌释放调节主要在基因表达水平,利钠肽,心脏利钠肽受体,心脏利钠肽体内清除,NPR-C介导的细胞吞饮和溶酶体降解中性内肽酶（neutral endopeptidase，NEP）降解: 裂解环状结构肾脏清除,de Lemos, et al. BNP in Cardiovascular Disease. Lancet 2003;362:316-322.,心脏利钠肽的生物半衰期,心脏利钠肽的主要生理作用,肾脏 增加肾小球滤过，抑制钠重吸收 排钠利尿血管 血管平滑肌松弛，舒血管作用 降低血压，减轻心脏前负荷 抗血管组织增生和纤维化,心脏利钠肽的主要生理作用,内分泌系统 抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性 抑制某些其他激素（内皮素；血管加压素；等）活性神经系统 抑制中枢和外周交感神经系统活性,心脏利钠肽的主要生理作用,对心脏的直接作用 抗心肌细胞脂肪分解作用 抑制心肌细胞成纤维细胞 DNA 合成和细胞增殖 抑制心肌细胞肥大其他可能作用 参与凝血系统和纤溶系统调节 减少内皮功能损伤,心脏利钠肽的主要临床用途,临床心衰的诊断评价心脏功能心衰诊断和判定心衰程度的生化标志物快速、方便、客观,NYHA的心功能不全分级,Guthery and Schumann. J Am Acad Nurse Pract 1988;10:31-41.,BNP 和 NYHA 分级的关系（Biosite Triage 研究资料）,NYHA 分级,ng/L,NT-proBNP 和 NYHA 分级的关系（Roche Elecsys 研究资料）,NYHA 分级,ng/L,BNP 和 NYHA 分级的关系（Biosite 和 Bayer 研究资料）,NYHA 分级,ng/L,BNP用荧光免疫分析法检测，定性试验仅需15MIN,定量试验还有ELISA法，约需2.5H，判断值为BNP22PMOL/L（100PG/L）。非CHF患者BNP平均水平111PG/L。 心功能I级： 患者BNP 平均水平244 PG/L, 心功能II级： 患者BNP平均水平389 PG/L, 心功能III级：患者BNP平均水平640 PG/L, 心功能IV级： 患者BNP平均水平817 PG/L,总的急性充血性心衰BNP平均水平675 PG /L。,心脏利钠肽的主要临床用途,呼吸困难的鉴别诊断心源性还是肺源性？,呼吸困难患者的BNP,de Lemos, et al. BNP in Cardiovascular Disease. Lancet 2003;362:316-322.,心脏利钠肽的主要临床用途,心血管疾病预后估计和危险性分类心衰的预后评价 预测再次患病率和死亡率急性心肌损伤后的预后评价 预测再次患病率和死亡率 估计心肌缺血损伤范围ACS危险性分级,ACS后NT-proBNP的预示作用,Galvani, et al. Natriuretic Peptide in Acute Coronary Syndromes. Circulation. 2004;110:128-134.,不稳定心绞痛后NT-proBNP的预示作用,James, et al. NT-proBNP and Prediction of Mortality and MI in Unstable CAD.Circulation 2003;108:275-281.,不稳定心绞痛后NT-proBNP的预示作用,James, et al. NT-proBNP and Prediction of Mortality and MI in Unstable CAD.Circulation 2003;108:275-281.,心脏利钠肽的主要临床用途,治疗效果的监测 浓度变化与疗效相关 根据变化调整药物剂量；估计疗效其他心脏移植术高危人群筛查心脏手术预后,BNP在冠脉搭桥术后的应用,Hutfless, et al. BNP Levels and Bypass Surgery. J Am Coll Cardiol 2004;43:18731879.,BNP 和 NT-proBNP的检测分析,*数据引自: Yeo, et al. Multicenter Evaluation of the Roche NT-proBNP Assay and Comparison to the Biosite Triage BNP Assay. Clin Chem Acta 2003;338:107-115.,EDTA血浆标本中的稳定性实验比较*,Bayer ADVIA Centaur 的 BNP 检测,1,10,21,30,39,50,60,76,70,抗原决定簇 1:捕捉抗体,抗原决定簇 2: 检测抗体,NT-proBNP,Elecsys NT-proBNP 检测位点,BNP 和 NT-proBNP的检测分析,检测心衰时的临界值（建议）,Cowie, et al. Clinical Applications of BNP Testing. Euro Heart J 2003; 24:17101718.,BNP 和 NT-proBNP的检测分析,检测方法中需进一步解决的问题增加分析敏感性和精密度 参考范围上限的检测不精密度（CV）10%增加分析特异性（准确性）和检测标准化 不同检测方法之间的可比性增加临床检测可操作性 利于常规检测，TAT短，费用合理,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,心血管炎症疾病的标志物,C 反应蛋白（CRP） ACS炎症、损伤的早期标志物。在心肌损伤发病后几小时即出现异常增高且“窗口期”较短，在心绞痛等心肌损伤的早期诊断和预后估计中有较好的临床价值 超敏 C 反应蛋白（hs-CRP）,hs-CRP的临床应用,大量研究资料表明，动脉粥样化的血栓形成除了是脂肪堆积过程外，也是一个慢性炎症过程，而CRP是动脉粥样化血栓形成疾病的介导和标志物CRP对心绞痛、急性冠脉综合征和行经皮血管成形术患者，具有预测心肌缺血复发危险和死亡危险的作用,hs-CRP的临床应用,CRP 在动脉粥样硬化中的可能作用激活补体系统增加分子间黏附作用增强吞噬细胞对 LDL 的吞噬作用刺激 NO 的生成增强纤溶酶原激活抑制物的表达和活性 等,hs-CRP的临床应用,前瞻性研究资料显示，CRP是比LDL-ch更有效的心血管疾病预测指标CRP在代谢综合征的几乎所有过程中都起着重要的作用，这是CRP与LDL-ch明显不同的另一个显著特点血脂评价加CRP评价可增加预测价值,Ridker