实验室生物安全讲座二

实验室生物安全,2,第四章 实验室生物安全的主要设备与仪器,3,4,常用可防护生物危害的仪器装备,移液器,生物安全柜,高压灭菌锅,灭菌器,一次性接种环,护目镜,防护服,目的：隔离操作者和感染性样本，防止操作人员被感 染安全设备 - 生物安全柜 个体防护装备 - 防护服；安全眼睛；手套鞋套；呼吸防护装置；紧急冲洗装置等。,华盛顿大学中学生游戏 防护,5,第一节 生物安全柜,6,一、生物安全柜概述,（一）概念： 生物安全柜（biological safety cabinet,BSC） 是操作有感染性的材料时，用来保护操作者本人、实验室环境及实验材料，使其避免暴露于操作过程中产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的负压排气柜。,7,生物安全柜的基本设计已经历了多次改进。主要的变化是在排风系统增加了HEPA（High Effieiency Particulate Air Filter）过滤器。对于直径0.3m 的颗粒，HEPA 过滤器可以截留99.97%，而对于更大或更小的颗粒则可以截留99.99%。HEPA 过滤器能够有效地截留所有已知传染因子，并确保从安全柜中排出的是完全不含微生物的空气。生物安全柜设计中的第二个改进是将经HEPA 过滤的空气输送到工作台面上，从而保护工作台面上的物品不受污染。,8,生物安全柜的选择,9,1. I级生物安全柜,I 级生物安全柜能够为人员和环境提供保护，但不提供产品保护。用途：I级生物安全柜被用作特殊的密封设备（例如离心、收获设备或小的发酵设备）或可能产生气溶胶的操作过程（例如倒笼子的垃圾，通气培养或组织搅拌）。也可用来操作放射性核素和挥发性有毒化学物品 。,10,B型,2. II级生物安全柜,II 级生物安全柜能够为人员、环境和产品提供保护。 用途：进行生物安全水平1、2、3级相关的操作。,A型,11,II级生物安全柜的种类,12,II级A2型生物安全柜,13,3. III级生物安全柜,14,生物安全柜的选择,15,二、生物安全柜的使用,（一）个人防护要求：使用生物安全柜时必须穿个人防护服，戴手套（手套应套在隔离衣的外面）最好带口罩和帽子，根据需要带防护眼罩或者面罩。工作之前，操作者应调节凳子高度确保自己的脸在开口之上。,16,（二）生物安全柜内物品摆放原则：按照从洁净区到污染区的方向摆放。所有物品尽可能放在远离前格栅，靠近操作台后缘的位置。将废弃物袋、盛放废弃吸管的托盘以及吸滤瓶等体积较大的物品放在柜内某一侧。前格栅不能被实验记录本、仪器设备或者其他物品阻挡。,17,（三）生物安全柜的操作流程:,18,（四）生物安全柜的使用注意事项,安全柜只有在工作正常时才能使用。双臂垂直缓慢进入前面的开口，在生物安全柜中等待大约一分钟，以使安全柜调整完毕后才可对物品进行处理。废弃物应丢弃在生物安全柜内的处理容器中，避免胳膊在前开口处快速移动和频繁进出,以免干扰气流。尽量避免污染的物品进入洁净区。在生物安全柜内进行操作时，不能进行文字工作。柜内所有的工作要在工作面的中部或后部进行，并能从观察面板中看到。 前送风格栅不得被便签、滴管、或其他材料堵住，否则会干扰气流从而可能使材料受到污染，使人员处在暴露状态。清洁和消毒:应在每次工作完成后及一天结束时，使用合适的消毒剂清洁安全柜的表面。 柜子的风扇在工作开始前和工作完成后要再各运行5分钟。,19,20,21,三、超净工作台,超净工作台是为保护试验样品而设计，通过吹过工作区域的层流空气防止试验样品受粉尘或细菌的污染。,22,水平层流的洁净台原理图,垂直层流洁净台原理图,超净工作台中不能操作感染性的材料，因其气体是正压直接排放。一旦感染性样品放置于工作区域，层流空气将把带有微生物介质的空气吹向前台正在操作的工作人员而产生危险。,23,生物安全柜与超净工作台的区别,24,除了了解安全柜各项性能指标，最好最快最方便鉴别安全柜安全性能的方法是了解您购买的安全柜是否获得过以下几项主要的国际安全柜认证： EN12469 (欧洲生物安全柜统一标准) NSF49 (美国生物安全柜标准-二级生物安全柜) AS2252.2 (澳洲生物安全柜标准-二级生物安全柜) JIS K3800 (日本生物安全柜标准),25,第二节 灭菌器,26,一、概念： 泛指能达到灭菌要求的一切设备，即能在一定时间内杀灭一切活的微生物（包括细菌芽胞）的设备，灭菌的保证水平为106 （即一件物品经灭菌处理后仍然有微生物存活的概率为106）。 二、灭菌器的种类： 1. 高压蒸汽灭菌器最常用 2. 干热灭菌器 3. 环氧乙烷灭菌器和过氧化氢等离子体灭菌器。,27,三、使用高压蒸汽灭菌器的注意事项 1.需要灭菌的各种包裹不应过大过紧。 2.放入灭菌器内的包裹不能排得太紧。 3.定期做好灭菌效果检测。 4.易燃易爆物品禁用高压蒸汽灭菌法。 5.瓶装液体灭菌时，所盛液体不超过瓶体积的3/4 。 6.每次灭菌前，应检查安全阀的性能是否良好，使用中也 应密切观察运行是否正常，及时发现问题，以免发生意 外。 7.在使用高压蒸汽灭菌过程中，应注意排尽灭菌器内冷空 气。 8.达到灭菌时间后，关闭电源，使压力自然下降，压力指针 到“0”后，方可打开锅盖。,28,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理,29,原核生物型微生物： 包括两个菌（细菌、放线菌），四个体（衣原体、支原体、立克次体、螺旋体）.,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理 - 病原微生物的种类及特点,30,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理 - 病原微生物的种类及特点,原核生物型微生物的特点： 1. 大部分细菌可在人工培养基上生长繁殖。 2. 构成细菌毒力的物质基础主要包括细菌的侵袭力(invasiveness) 毒素（toxin）. 细菌致病性的强弱与细菌的毒力、侵入机体的数量、入侵途径及机体的免疫状态密切相关。 3. 细菌感染可采用抗生素来治疗。,31,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理- 病原微生物的种类及特点,真核生物型微生物： 真菌（单细胞真菌和多细胞真菌）特点： 1. 真菌的致病： 浅表真菌感染-如:皮肤癣菌。真菌机会性感染-如：白色念珠菌，新型隐球菌。真菌毒素的致病作用-真菌中毒和引起肿瘤（黄曲霉毒素）。真菌性超敏反应。 2. 治疗： 对细菌抗生素不敏感，必须采用抗真菌药物治疗。,32,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理 - 病原微生物的种类及特点,非细胞型微生物： 病毒病毒结构：核酸（DNA / RNA）,蛋白衣壳，包膜（某些病毒有）；病毒特点：1. 在易感的活细胞中寄生。病毒的致病作用主要通过侵入易感细胞、损伤细胞或改变细胞功能而引发。2. 病毒感染用抗生素治疗无效，目前理想的抗病毒药物不多。,33,34,第 五 章 病原微生物实验室生物安全管理 - 病原微生物的种类及特点,非细胞型微生物： 朊粒（prion）： 朊粒的特点： 1. 一种特殊的致病因子，只含蛋白质，不含核酸。 2. 朊粒： 是一种由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的朊蛋白，是人和动物的传染性海绵状脑病（TSEs）的病原体。TSE 可通过多种途径传播（消化道、血液、神经及医源性）。 3. 抵抗力很强，一般高压灭菌条件不能破坏。 对患者的血液、体液，手术器械等必须用 1mol / L NaOH 处理 1小时, 再高压灭菌 134 C, 2小时。,35,一、病原微生物的风险等级,36,二、病原微生物实验室生物安全防护,37,（一） 病原微生物样本的采集,病原微生物菌（毒）种、样本及已知或疑含病原体的物质均称为感染性物质。基本要求：1.采集设备与器材： 必须有相应的生物安全防护设备与器材。如个人防护用品（隔离衣、帽、口罩、鞋套、手套、防护眼镜等）、防 护器材、生物安全防护设施和实验条件等。2. 采集人员与操作规范： 必须由掌握相关专业知识和操作技能的工作人员进行采集 遵循生物安全操作规范 具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段 具有详细的样本采集记录 具有应急措施与预案3. 样本的分类、包装与运输： 必须按规定要求对感染性物质行分类、包装与运输。疑似高致病性病原微生物样本，应该采取特殊明确的标示.,38,（二）病原微生物菌（毒）种的保藏与管理,1. 菌（毒）种的供应： 第一类、第二类菌（毒）种： 由卫生部指定的保藏管理机构统一供 应，其他任何单位或个人不得对国内、外办理。 第三类、第四类菌（毒）种：专业实验室负责供应所管理的菌（毒） 种，其他菌（毒）种均由各有关保藏管理中心供应。 2.菌（毒）种的使用: 使用单位需符合生物安全要求的条件和设备。菌（毒）种应有专人负责管理，建立必要的制度。 *使用第一类菌（毒）种的单位，必须经国务院卫生行政部门批准； *使用第二类菌（毒）种的单位必须经省、自治区、直辖市卫生行政部门批准； *使用第三类菌（毒）种的单位，应当经县级卫生行政部门批准。,39,（三）实验废弃物的处理,处理方式如下：,国外严格规定,40,41,第六章 临床实验室生物安全管理,42,一、临床实验室的生物安全隐患 最大隐患： 存在大量未知因素带来的风险。 临床实验室接收的标本很多是来源于未知疾病的个体，其中是否含有致病因子及其危害性大小、传染途径均不明。 二、临床实验室的生物安全准则 防护原则：假设所有来自病人的血液、体液和 组织都具有传染性！ 要求临床实验室人员严格按照实验室安全操作规程操作，重要是降低溅出和气溶胶的产生。,43,临床检验相关生物危险等级分布,44,医务人员职业防护认定病人的血液、体液、分泌物、排泄物均具有传染性，接触上述物质者必须采取防护。双向防护，既防止疾病从病人传至医务人员，又防止疾病从医务人员传至病人,45,防护措施（问题：意识薄弱 措施不到位） l 洗手：接触病人的污染物时，不论是否戴手套，都必须洗手。 2 戴手套： 3 有可能发生喷溅时，应戴眼罩和口罩，并穿防护衣。 4 被污染的医疗用品和仪器设备应及时处理! 5 锐利器具和针头应小心处理，以防被刺伤。 6 接种疫苗 （乙肝疫苗 ）,46,三、临床实验室安全操作的基本要求一般临床实验室应按BSL-2的要求。安全防护措施包括安全操作规范程序安全防范制度和废弃物处理制度等。 （1）所有处理血液、体液或其他可能具有传染性的物质（包括接触病人 的黏膜或有损伤的皮肤、或在处理污染的物品或表面时）的工作人 员都应戴手套，如果有可能发生血液或体液的喷溅，或必须在生物 安全柜外处理微生物时，则应使用面部防护装备。如果手套破损、 刺破、或失去其屏障功能，则应尽快更换。一次性手套不得重复使 用，在接触病员后应更换手套。不能戴着手套离开实验室或接触 “洁净”设施表面（如键盘、电话、门柄等）。（2）工作台面应铺垫一块具有吸收性能的材料，以防止液体滴落或溅 落造成的感染性物质扩散，使用后按感染性废弃物处理。（3）所有可能产生气溶胶或飞沫的操作都应在生物安全柜中进行。,47,（4）实验室应使用机械移液装置，绝对禁止用口吸移液。 （5）禁止用手直接处置注射器及其他锐器，以防止损伤； 使用后或废弃的锐利物品都应放入专用容器内，并及 时运走处理。 （6）实验中用过的污染物品在重复使用或装入容器中按传 染性废弃物进行处理前，应先进行去污处理。 （7）被血液或其他体液污染的设备在进行维修之前应先进 行清洁和消毒，无法彻底消毒的设备必须贴上生物危 害警告标签。 （8）手或其他部位的皮肤在接触血液或其他体液后必须立 即彻底清洗，在实验工作结束后或取下手套后应立即 洗手;在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装备。 （9）血液或其他体液发生泄漏或工作结束后，要及时用合 适的化学杀菌剂对实验室工作区进行表面消毒。,48,临床实验室安全操作的基本要求,（2）工作台面应铺垫一块具有吸收性能的材料，以防止液体滴落或溅落造成的感染性物质扩散，使用后按感染性废弃物处理。 （3）所有可能产生气溶胶或飞沫的操作都应在生物安全柜中进行。,49,临床实验室安全操作的基本要求,（4）实验室应使用机械移液装置，绝对禁止用口吸移液。 （5）禁止用手直接处置注射器及其他锐器，以防止损伤；使用后或废弃的锐利物品都应放入专用容器内，并及时运走处理。 （6）实验中用过的污染物品在重复使用或装入容器中按传染性废弃物进行处理前，应先进行去污处理。,50,（7）被血液或其他体液污染的设备在进行维修之前应先进行清洁和消毒。 （8）手或其他部位的皮肤在接触血液或其他体液后必须立即彻底清洗，在实验工作结束后或取下手套后应立即洗手；在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装备。 （9）血液或其他体液发生泄漏或工作结束后，要及时用合适的化学杀菌剂对实验室工作区进行表面消毒。,51,动物尸体解剖毒液滴到物品表面打开容器的螺旋盖摔碎有培养物的瓶、平皿注射器从安瓿抽取毒液离心时离心管破裂打开、打碎干燥菌种安瓿管注射器针尖滴出的毒液拍打、刷衣服搅拌小白鼠鼻内接种,可造成中重度气溶胶的操作,52,血液成分制备人员:,据文献显示: 无偿献血者HBsAg 、 抗-HCV 、 抗-HIV的感染率分别为6.1%、2.2%和0.03%;未明原因的血液传播性疾病不断地增加;采集、制备血液标本，难免面临很多危险因素和意外暴露。,53,危险因素：1 物理因素 包括针刺损伤和操作擦伤。针头刺伤为采集成分血样标本后针头误投垃圾桶，捡回时碰伤手指；据统计，血站职工职业暴露中针刺占77.78%，皮损污染占15.7%，黏膜污染占6.52%2。2 生物因素 主要包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒、结核杆菌、流感病毒等。据研究含病毒高的血液和体液依次为：血液、血液成分、伤口分泌物、精液、阴道分泌物、羊水等。,54,Is it a sharps hazard?,Examples:needlessyringesscalpelsall biologically contaminated objects that can easily penetrate skin (Pasteur pipettes,razor blades, etc.),Place sharps in approved sharps container for disposal!,55,3. 隐患因素： 医疗废弃物（基本上属于感染性废物）；， 损伤性废物；， 主要包括： 成分血转移袋；一次性耗材；一次性生理盐水和废抗凝剂；注射器及针头； 渗漏血袋；一次性工作服、帽子、口罩、手套等。,56,发现损伤后的护理 :发生针头刺伤，操作中擦伤、割伤等时：(1)暂时停止接触血液工作；(2)立即脱去乳胶手套，用生理盐水冲洗查看伤情；(3)在伤口近心端向远心端挤压伤口，尽可能挤出损伤处的血液，再用流水进行冲洗完成后用0.5%碘伏消毒，并包扎伤口；(4)已污染的工作服先消毒后清洗；(5)查看制备的血袋条码，以便检查结果(6)登记受伤情况及处理方法；(7)伤情严重者实施生物安全应急预案并接受医学观察。,57,急诊科,急诊患者特点： 在潜伏期的患者和未明确诊断的传染病患者较多。必须树立的观念：把任何患者的血液及污染物；呼吸道排泄物等；都认为具有潜在感染性，加强自我防护。防护措施：戴帽子 口罩 手套，隔离衣等，在特殊情况下可考虑戴双层手套（在工作服的口袋内备 2 双手套，便于在紧急情况下使用）；重视洗手 ！实施预防接种：如甲肝 乙肝 流感疫苗等，,58,抗肿瘤药和其他危险药物的生物防护,危险药物： 指具有致癌性、 致畸性、 生殖毒性、 遗传毒性及低剂量致器官毒性的药物。包括： 抗肿瘤药、 抗病毒药、 激素、 免疫抑制剂等。,59,职业暴露风险：研究表明：医务人员在诊疗、配制和使用危险药物等过程中可直接或间接暴露于危险药物,产生不良反应。暴露的途径：呼吸道吸入、 皮肤接触吸收、 消化道摄入等。危害： 职业暴露危险药物可导致机体免疫力 降低、 发生肿瘤的危险性增加和潜在的生殖损害。,60,安全防护措施: 1，制定安全操作规程; 对可能接触危险药物的 医务人员加强安全教育和培训; 2，设置专用配药场所; 使用生物安全柜; 3，个人防护：装备包括手套、 隔离衣、 护目镜、 面罩等;4，加强对废弃物处理的管理;,61,正确使用个人防护设备 ： 如防护服、手套、目镜、一次性帽子、口罩及鞋套。防护服： 宜穿一次性低穿透性隔离衣 ,有条件可选用正压连身工作服； 隔离衣应具有低穿透性、 开口向后、长袖紧袖口;,62,手套：研究证明戴手套是预防抗肿瘤药物皮肤暴露的最有效手段, 值得注意的是手套的厚度比质地更为重要,应使用无粉、 厚、 长的乳胶手套,长度能覆盖住隔离衣袖口为宜 ；Slevin 等的研究指出 ,乳胶手套防渗透功能差 ,而聚乙烯手套具有防渗透功能 ,但由于聚乙烯手套比较薄 ,使用过程中容易破损且不易于精细操作 ,因此建议戴双层手套 ,在聚乙烯手套外加戴一层乳胶手套 ,注意手套须盖住袖口。 戴手套前及脱手套之后应认真洗手。切忌因怕麻烦而简化防护程序。,63,配药注意事项 在进行药物配制操作时, 打开安瓿时应垫以纱布,以防划破手套;打开粉剂安瓿时,应用无菌纱布包裹; 溶解药物时, 溶媒应沿安瓿壁缓慢注入瓶底, 以防粉沫溢出。抽取药液选用一次性注射器,以不超过容器的 3 /4容积为宜,排气时应排到密闭容器中。,64,有害污物的管理： 接触化疗药物的用具、 污物应放入专用袋内集中封闭处理,收集容器应坚固、防漏和带盖,有明确标识。勿在放置抗肿瘤药物的冰箱中存放食品;勿在操作室内饮水和进食。,65,发生急性危险药物暴露后的紧急处理： 如不慎将药液溅到皮肤上或眼睛内, 可用大量清水或氯化钠注射液反复冲洗接触部位的皮肤,记录接触情况,必要时按化疗药外漏处理。,66,第七章 基因工程实验室的生物安全管理,67,基因工程： 包括 1. 利用载体系统的重组体DNA 技术 2. 利用物理或者化学方法把异源DNA 直接导入有机体的技术 基因工程: 具有巨大应用前景基因工程安全性问题也受到广泛关注重组DNA技术可能制造出具有潜在危险的新型微生物，对人类、动物和环境造成威胁 涉及 “生物安全性”问题,68,69,一、基因工程实验室的危险因素,1.材料危害,70,2.仪器使用的危险因素 高压灭菌锅 离心机 凝胶成像系统 电泳系统 超声破碎仪电穿孔仪杂交炉 3.有害化学试剂溴化乙锭焦碳酸二乙酯（DEPC）Trizol秋水仙素氯仿 ,71,二、安全防护原则,基本原则： 1. 确保实验操作人员的安全。 2. 确保实验操作场所及周边环境的安全。 3. 确保实验仪器设备正常运作的安全。 4. 确保实验操作对象的安全。 一级屏障： 生物安全柜、通风橱柜、高压灭菌锅等。 二级屏障： 实验室设计建造、设备配置等。,72,三、生物安全评估,安全性评估考察的依据主要建立于: 1.生物表达系统的生物安全性 2.转基因动物和基因敲除动物的安全性。 3.转基因植物的生物安全性。 4.遗传修饰的生物安全性。,73,三、基因工程的安全控制,（一）相关法规 我国相继颁布了基因工程安全管理办法（1993年）和农业转基因生物安全管理条例（2001年），以及其他相关的微生物学实验室生物安