分析化学高效液相色谱法ppt课件.ppt

第十八章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography HPLC 经典液相色谱法为基础 引入气相色谱法的理论和实验技术 高压输送流动相 高效固定相及高灵敏度检测器 现代液相色谱分析方法 与经典液相色谱法相比 颗粒极细 一般为10 m以下 规则均匀的固定相 键合相 传质阻抗小 柱效高 分离效率高 高压输液泵输送流动相 流速快 分析速度快 高灵敏度检测器 灵敏度大大提高 紫外检测器最小检测限可达10 9g 而荧光检测器最小检测限可达10 12g 与气相色谱法相比 不受试样的挥发性和热稳定性的限制 应用范围广 可选用各种溶剂作为流动相 对分离的选择性有很大作用 选择性高 一般在室温条件下进行分离 不需要高柱温 第一节高效液相色谱法的主要类型和原理 一 主要类型四类基本类型色谱法分配色谱法 partitionchromatography 吸附色谱法 adsorptionchromatography 离子交换色谱法 IEC 空间排阻色谱法 SEC 第一节高效液相色谱法的主要类型和原理 一 主要类型四类基本类型色谱法分配色谱法 partitionchromatography 吸附色谱法 adsorptionchromatography 离子交换色谱法 IEC 空间排阻色谱法 SEC 化学键合相色谱法 其他色谱类型亲合色谱法 affinitychromatography AC 手性色谱法 chiralchromatography CC 胶束色谱法 micellarchromatography MC 电色谱法 electrochromatography EC 二 化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法 简称键合相色谱法 bondedphasechromatography BPC 化学键合相 采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相 优点 固定相的均一性和稳定性好 在使用过程中不易流失 使用周期长 柱效高 重现性好 能使用的流动相和键合相的种类多 分离的选择性高正相 normalphase NP 和反相 reversedphase RP 键合相色谱法 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 一 正相键合相色谱法 固定相 极性键合相如氰基 CN 氨基 NH2 或二羟基键合硅胶 经典 水饱和的硅胶 流动相 非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类 与水不混溶的溶剂 适用范围 溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质 正相键合相色谱法 分离机制 分配 把有机键合层作为一个液膜看待 溶质在两相的溶解吸附 溶质与键合极性基团间的诱导 氢键和定向作用分离选择性 极性强的组分k大 后洗脱出柱 流动相的极性增强 洗脱能力增加 使组分k减小 tR减小 二 反相键合相色谱法 固定相 非极性键合相如十八烷基硅烷 C18 ODS 辛烷基 C8 键合硅胶流动相 水为基础溶剂 加入一定量与水混溶的极性调整剂常用甲醇 水 乙腈 水等应用 最广非极性至中等极性的组分 还有有机酸 碱及盐等 保留机制疏溶剂 solvophobictheory 溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力 促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合 不是溶质分子与键合相间的色散力 反相键合相色谱法 保留行为的主要影响因素1 溶质的分子结构 极性 极性越弱 疏水性越强 k越大 tR也越大 同系物碳数越多 极性越弱 k越大 引入极性取代基 降低疏水性 k值变小 2 固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加 溶质的k也增大 硅胶表面键合烷基的浓度越大 则溶质的k越大 反相键合相色谱法 保留行为的主要影响因素 反相键合相色谱法 保留行为的主要影响因素3 流动相极性越强 洗脱能力越弱 使溶质的k越大溶剂种类 水为弱溶剂 醇为强溶剂溶剂比例 水的比例增加 使k增大中性盐的加入 使中性溶质的k增大pH 影响弱酸 弱减的离解流动相的pH降低 弱酸k增大 tR增大 弱碱k变小 离子抑制色谱法 ionsuppressionchromatography ISC 用少量弱酸 弱碱或缓冲溶液 调节流动相的pH 抑制有机弱酸 弱碱的离解 增加疏水缔合作用 使k变大 适用于3 pKa 7的弱酸 7 pKa 8的弱碱 反相键合相色谱法 把离子对试剂加入到含水流动相中 组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子 counterion 生成中性离子对 增加溶质与非极性固定相的作用 使k增加 改善分离效果 三 反相离子对色谱法pairedionchromatography PICionpairchromatography IPC 反相离子对色谱法 离子对模型 3 3 3 s 3 固定相 B 流动相 通式 影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度 碳链长度增加 溶质的k增大 在一定范围内试剂的浓度升高 溶质的k增大流动相的pH 有利于组分和离子对试剂离子化时 离子对的形成 组分的k值最大固定相 流动相性质 同一般RP HPLC 适用范围和离子对试剂的选择 适用范围 有机酸 碱 盐 离子型和非离子型化合物的混合物 分析酸类或带负电荷物质 用季铵盐 如四丁基铵磷酸盐 TBA 和溴化十六烷基三甲基铵 CTAB 等 分析碱类或带正电荷的物质 用烷基磺酸盐或硫酸盐 如正戊烷基磺酸钠 PICB5 正己烷基磺酸钠 PICB6 第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 固定相应符合下列要求 颗粒细且均匀 传质快 机械强度高 能耐高压 化学稳定性好 不与流动相发生化学反应 一 化学键合相色谱法的固定相 一 键合相的种类非极性键合相 非极性烃基 如C18 C8 C1与苯基等键合在硅胶表面 用于反相色谱 长链烷基可使溶质的k增大 选择性改善 载样量提高 稳定性更好 键合相的种类弱极性键合相 醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱极性键合相 常用氨基 氰基键合相 氰乙硅烷基 Si CH2 2CN 键合硅胶一般用于正相色谱特殊用途的键合相 二 键合相的性质和特点 键合反应硅氧烷 Si O Si C 型 氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 如 YWG C18H37 无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基 SpherisorbODS 球形硅胶Spherisorb上键合了ODS 键合相的性质和特点 键合相的性质含碳量 含碳的百分数覆盖度 已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例封尾 end capping 在键合反应后 用三甲基氯硅烷等进行钝化处理 减少残余硅醇基 键合相的特点使用过程中不流失 化学稳定性好 适于梯度洗脱 载样量大注意 流动相的pH一般应在3 8 否则会引起硅胶溶解 也有适用宽pH范围的键合相 键合相的性质和特点 二 化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求 与固定相不发生化学反应 对试样有适宜的溶解度 使k在1 10范围内 与检测器相适应 例如用紫外检测器时 选用截止波长小于检测波长的溶剂 纯度高 粘度小 低粘度流动相如甲醇 乙腈等可以降低柱压 提高柱效 一 流动相对分离的影响n由色谱柱 固定相 性能决定 主要受溶剂种类的影响 k受溶剂配比的影响 二 流动相的强度和选择性溶剂的极性 强度 正相色谱 溶剂极性越强 洗脱能力越强反相色谱 极性弱的溶剂洗脱能力强溶剂的选择性不同种类的溶剂 分子间的作用力不同 故选择性不同混合溶剂 二元或多元流动相 三 分离条件的选择 一 HPLC中的速率理论涡流扩散A 2 dp球形 小粒度 均匀 RSD 5 固定相 匀浆高压填充 以降低A 纵向扩散 2 Dm可以忽略 因为Dl很小 室温操作 且U大于U最佳 HPLC中的速率理论 传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略 因df极小流动相传质阻抗Cm要求 dp小 Dm大 静态流动相传质阻抗 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数CsmCsm dp2 Csm 1 Dm 而Dm T 要求 固定相dp2 流动相 都小 HPLC中的速率理论 H A Cmu Csmu原因 化学键合相 液体流动相结果 HPLC的实验条件应该是 小粒度 均匀的球形化学键合相 低粘度流动相 流速不宜过快 柱温适当 HPLC中的速率理论 二 正相键合相色谱法的分离条件 固定相极性键合相如氰基 氨基键合相等流动相烷烃加适量极性调节剂 三 反相键合相色谱法的分离条件 固定相非极性键合相如ODS流动相以水为基础溶剂 加入甲醇 乙腈等极性调节剂弱酸 弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入0 1 1 的醋酸盐 磷酸盐可减少残余硅醇基的作用 四 反相离子对色谱法的分离条件 固定相尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相 离子对试剂离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反流动相pH使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂及其浓度同一般HPLC 第三节高效液相色谱仪 组成输液系统进样系统色谱柱系统检测系统数据记录处理系统 一 输液系统 高压输液泵恒流泵 在输送流动相过程中流量恒定 常用柱塞往复泵双泵 为了克服流量的脉动 有串联式和并联式 输液系统 输液泵应具备的性能 流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好 耐腐蚀 输液系统 输液泵操作注意事项 防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气 二 分离和进样系统 进样器进样阀 六通阀 自动进样装置色谱柱 column 由柱管和固定相组成分析柱 制备柱性能评价H n fs k和 的重复性 或R 三 检测系统 一 检测器 detector 的主要性能要求 灵敏度 sensitivity 高 检测限低 噪音 noise 低线性范围 linearrange 宽重复性 repeatability 好适用范围广 通用型 专属型 二 紫外检测器 ultravioletdetector 检测原理 朗伯 比尔 Lambert Beer 定律 响应信号 吸光度 与浓度成正比A Cl特点 灵敏度较高 10 6 10 9g ml 噪音低 线性范围宽 稳定性好 适于梯度 不破坏样品 应用广 分析 制备 局限 只能检测有紫外吸收的物质 流动相的截止波长应小于检测波长 专属型 浓度型检测器 紫外检测器 固定波长检测器 254nm可变波长检测器 光源 氘灯 和钨灯 200 400 800 nm 单色器 流通池 试样 光电管光路系统和紫外分光光度计相似光电二极管阵列检测器 photodiodearraydetector PDAD 一系列光电二极管 一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光 紫外检测器 光电二极管阵列检测器工作原理 复光通过流通池 再进入单色器 分光后照射在二极管阵列装置上 同时获得各波长的信号强度 即获得组分的吸收光谱 获得三维光谱 色谱图 用途 吸收光谱用于组分的定性 色谱峰面积用于定量 判断峰纯度 紫外检测器 三 荧光检测器 fluorescencedetector FD 检测原理 化合物受紫外光激发后 发射出比激发光波长更长的光 称为荧光 荧光强度 F 与激发光强度 I0 及荧光物质浓度 C 之间的关系为 F 2 3QKI0 ClQ为量子产率 K为荧光效率 为摩尔吸光系数 l为光径长度 F KC 荧光检测器 fluorescencedet