分子诊断与个体化治疗湖南中西医结合学会检验医学专业委员会ppt课件.ppt

临床分子诊断与个体化治疗 2014 11 3 分子诊断 狭义分子诊断 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术 称为分子诊断 包括肿瘤分子诊断 传染病分子诊断 产前诊断等 广义分子诊断 指应用分子生物学方法 对受检者体内各类生物分子 包括DNA RNA 蛋白质等 进行定性和定量分析 确定其结构或表达水平 从而为个性化预防 治疗提供依据的一种诊断技术 包括肿瘤分子诊断 传染病分子诊断 产前诊断 单基因诊断 易感基因检测以及天赋基因检测等 PCR国内回顾 1990年 PCR技术在国内开始用于临床检测90年代中期 假阴性 假阳性 引发思考1996年 卫生部科研课题1998年3月20日 临床PCR实验室管理专家咨询会1998年4月16日 卫生部下发 国内回顾2 1999年4月29 30日 针对临床开展PCR检验的问题 达成八点意见 1999年8月17 24日 在北京卫生部临床检验中心举办 2002年1月14日 卫生部下发 卫医发 2002 10号 2010年 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 卫办医政发 2010 194号 医疗机构临床基因扩增检验室工作导则 卫办医政发 2010 194号 截止到2014年1月 全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实验室共2670余家 采用所编写的培训教材和培训模式共举办了培训班280多期 培训实验室技术人员21000多人 涉及全国28个省 直辖市和自治区 目前国内临床分子诊断现状 绝大部分用于病原体核酸检测较少部分用于遗传病的产前诊断个体化用药的分子诊断正在兴起 一些常见的认识误区 临床实验室 检验科基因 遗传携带 突变等 与病原体核酸检测完全不同临床PCR检验在病理科 药剂科或肿瘤科做 不属于临床检验管理 必须达成一点共识 实验不管在哪做 都属于检验管理 必须有严格的质量控制 问题与思考 问题 应用实验室分区质量管理 分析前 分析中 分析后人员 医生 实验室技术人员 均需 洗脑 严格的培训 出现问题 即分析问题产生的原因 采取措施加以改进质理管理的习惯养成需要时间 几个策略比较 家族病史研究与基因研究相比较说法不一 孰优孰劣 各有所长 肿瘤早期诊断带来的真正收益有没有我们所希望的那么大 WHOhasdevelopedthreeprinciplesforcancerissues Currentpreventionstrategiescouldblockuptoone thirdofallnewcancerImprovedearlysreeningcouldresultinthedetectionofone thirdofcanceratanearlystage Acomprehensivetreatmentcouldimprovesurvialaqualityanotherone thirdofpattientswithcancer 国家自然科学基金委医学部主任 国家肝癌科学中心主任 王红阳院士 中国肿瘤治疗现状 治愈率 10 五年生存率23 低于欧美国家31 57 低于日本27 和43 主要原因 1 早期诊断低2 缺乏规范化治疗3 经济状况差 华南肿瘤国家重点实验室 中山大学肿瘤防治中心 钱朝南教授 较早期诊断 和 提高治愈率和五年生存率46 72 分子诊断为肿瘤早期诊断提供技术支撑 个体差异与个体化医疗 个体差异 基础个体化医疗 Personalizedmedicine 这个名词最早由Gibson提出 其意义是家庭医生独立行医的意思 现代意义的个体化医学概念于1999年由Langreth和Waldholz在 Oncologist 杂志上首次提出 其意义是根据病人的遗传学背景 结合生物信息学和高端成像技术进行诊断 从而合理选择药物进行治疗 个体化医学的发展趋势 200 20 220 180 160 140 120 100 40 80 60 240 1999 2000 2001 2003 2007 2002 2004 2006 2005 2008 2009 2010 2011 Numberofarticlesperyearfrom1999to2011thatincludedtheterm personalizedfiguresonPubmed 260 280 个体化医学 GWAS分析方法 1 基因组规模微阵列基因分型平台 确定SNP和插入 缺失和拷贝数变异区域 copynumbervariation CNVS 2 比较基因组杂交芯片 comparativegenomichybridizationarry CGHarray 检测染色体拷贝数变化3 转录水平的基因表达平台 检测mRNA表达水平 4 大型数据集分析软件 常用的基因突变检测方法优缺点比较 检测方法 优点 缺点 直接测序法 可以检测所有突变 不灵敏 操作繁琐 易污染 RFLP 无特殊设备 价廉 不能定量 不能确定特殊突变 SSCP 无特殊设备 简便 快捷 灵敏 不能对突变精确定位 焦磷酸测序法 准确 可以检测质量的样本 测序长度短 易污染 HRM 可以检测所有突变 复杂 操作繁琐 ARMS 灵敏度高 周期短 需要特殊探针 每次只能检测一种突变 FDA批准的遗传检测试剂或设备 试剂 设备 生产厂家 FDA批准时间 检测样本类型及基因 检测方法 相关药物 RocheAmpliChipcytochromeP450GenotypingtestandAftymetrixGeneChipMicroarrayInstrumentationSystem 罗氏公司 2004 12 血CYP4502D6 基因芯片 Aripiprazole Atomoxetine Carceilor CerimelineChlordiazepoxide Amitrptyline DakocytomentionHer2FISHpharmOXkit 2005 05 组织 FISH Herceptin Trastuzumab Lapatinib DakocytomenationDenmarkA S Tag ltCysticFibrosiskit 2005 09 血 CRTR Tag lt平台 TmBioscienceCorporation Ivacaltor InvaderMolecularAssay 2005 08 外周血 FISH 三浪技术公司 Indacaterol Irinotecan Nilotinib InvitrogenSPOT LighHER2CISHKit 2008 07 组织 HER2 免疫荧光 Invitrogen公司 Herceptin Trstuzmab DakoHER2FISHpharmDx 2010 10 组织 HER2 FISH DakoDenmarKA S Herceptin Trstuzmab Cobas4800BRAFV600MutationTest 2011 08 组织 BRAF RT PCR 罗氏公司 Zeiboraf vemurafenib VysisALKBreakApartFISHProbeKit 2011 08 组织 ALK FISH 雅培公司 Xalkon crizotinb 基因突变和表达与肿瘤靶向治疗 肿瘤 治疗药物 检测位点 结果判断 结直肠癌 西妥腊单抗 Cetuximab 帕尼单抗 Paritumumab 12号染色体KRAS基因2号外显子的12密码子和13密码子 3号外显子的61号密码子 其中有7个突变热点 G12C G12R G12S G12V G12D G12A G13V D占到KRAS基因突变的90 以上 野生型治疗效果较好突变型治疗效果差 非小细胞肺癌 古非替尼 人类染色体7p13 q22区 第19位外显子的缺失 L858R T790M G719X L861Q S7681 第20位外显子的插入等 以前两者居多 占所有突变的90 野生型治疗效果较差突变型治疗效果好 乳腺癌 核赛叮 Herceptin 曲妥珠单抗 Her2 neu表达 Her2 neu表达者效果较好 特罗氨 Tarceva KRAS突变 基因多肽性与药物治疗 基因 药物 CYP2C19 伏立康唑 奥美拉唑 泮托拉唑 艾美拉唑 雷贝拉唑 地西洋 那非那韦 CYP2C9 塞来考替 华法林 CYP2D6 阿托西丁 文拉法辛 利哌利酮 塞托溴胺 他莫普芬 噻吗洛尔 氟西叮 奥氮平 西维美林 托特罗定 特比萘酚 曲马多 啊立哌唑 美托洛尔 卡维地洛 普罗帕酮 硫利达嗪 普罗替林 可待因 DPYD 卡培他滨 氟尿嘧啶乳膏外用液 G6PD 拉布立酶 氨苯矾 伯氨喹 氯喹 NAT 利福平 异烟肼 吡嗪酰胺 TPMT 硫唑嘌呤 硫鸟嘌呤 6 巯基嘌呤 VKORC1 华法林 IL28b基因多态性与丙型肝炎治疗及预后 基因多态性 结果判断 rs12979860 邻近IL28b基因 位于IFN r3编码基因上游3kb处 是目前已知的与HCV感染者的持续病毒应答 SVR 相关 其中C C与SVR相关联 C T和T T与非病毒应答 NVR 相关 SNPrs12979860T基因型也与应用PEG IFN RBV治疗引起的初相病毒载量的下降显著关联 但仅与1型慢性HCV患者的二相病毒载量下降有关 rs8099917 位于IL28b基因下游8kb 与非病毒学应答相关 其中T T为保护性基因型 G T与G G为非保护性基因型 G等位基因与乙肝病毒相关的肝细胞损伤密切相关 能提高SNPrs12979860C T基因型的非病毒学应答预测价值 rs12980275 位于IL28b基因下游2 4kb处 用于预测 型HCV应用PEG IFN RBV治疗效果 其中A A为保护性基因型 A G和G G为非保护性基因 但对感染2 3型HCV病毒患者无预测价值 SNPRS12980275A G基因型患者治疗前低密度脂蛋白 胆固醇 130mg dl HCVRNA 600000U ml 预期治愈率可能大于80 个性化检测的局限性 一些疾病是由一个或多个基因突变引起基因检测方法确实能对这些疾病的患病风险 确诊和治疗起指导作用大多数疾病发生 发展及预后可能涉及更多的基因以及这些基因和环境因素相互作用仅通过基因检测盒基因表达谱的检测有很大局限性 CLIA 分子检测有关的主要质控要求 对于每一个检测系统 实验室由此又控制程序的责任 监控整个分析过程的准确性和精密度 42CFR493 1256 A 控制程序必须是 o检出即时误差 由检测系统故障 不利于环境和操作者能力导致 42CFR493 1256 C 1 o监控检测性能的准确性和精密度 检测系统能和环境的改变以及操作者的能力都可能会影响检测性能 实验室必须确定使用检测物质的数量 类型和频率 如果适用 由实验室验证或建立性能规范 42CFR493 1256 b 如果实验室引进了未经FDA认可或批准的检测系统 包括自主研制的方法 在报告病人检测据结果前 必须建立检测系统的性能规范 如果适用 包括下面的性能特征 o准确性 o精密度 o分析灵敏性 o分析特异性 包括干扰物质 检测系统对检测结果的可报告区间 o参考区间 正常值 和o检测性能要求的其他性能特征 42CFR493 1253 b 2 包括提取过程中的检测系统包括两种质控物质 其中之一可以检出提取过程的错误 42CFR493 1256 d 3 iv 每一扩增过程 包括两种质控材料 如果反应的抑制是假阴性结果的重要来源一个质控材料能够检出该抑制作用 42CFR493 1256 d 3 v 国际相关机构的PT计划 CAP美国病理家协会CDC美国疾病预防控制中心 基因检测质量控制物计划GTQC QCMD分子诊断的质量控制EMQN欧洲分子遗传实验质控网ENVID欧洲重要病毒性疾病诊断网EQAP西班牙室间质评计划EQUAL欧盟质量控制一致行动 现在被称作分子诊断的质量控制QCMD INQAT意大利肿瘤标志物质量保证网NEQAS英国国家质量保证计划 临床基因扩增实验室的质量控制 一 实验室各种常规工作的规章制度实验室技术人员的生物安全制度和保护措施防止实验室PCR交叉污染的实验 每月一次 实验室的清洁和消毒制度 每周4 5次 实验室的原始数据 报告单的归档和信息保密制度实验室专业人员的培训和考核制度实验室结果差错的记录和纠正措施计算机的系统维护和管理制度 临床基因扩增实验室的质量控制 二 样本接收和拒收标准 抗凝剂 采集时间 量 病史 接收标本必须有专用的登记表 并核对样本登记表中的所有信息 2人复核和签字 每批样本核酸提取的过程中加入质控标本以保证标本处理的过程中的正确性 同时建立用于不同技术平台的标准化的DNA RNA浓度范围 定量PCR检测的操作过程包括4个不同浓度的对照物 以及阴性和阳性对照 样本的保存和存储 4 和 80 冰箱 临床基因扩增实验室质量控制 三 室内质控标本的来源 包括参加国内和国际质控标本 细胞株和已知实验结果的样本 在每批实验中和每个技术平台上均加入了质控样本 从样本抽提 基因扩增 杂交和测序已知跟踪到整个实验结果 每次实验结果分析后有专门的质控报告 实验室的技术人员每一个月 在每一个技术平台上都有一次盲样样本的质控实验 并以此评价技术人员的实验技能 分析的有效性 准确性o与参考方法比较o设定CUT OFF值的方法精密度 再现性o重复性 利用分子检测方法和同一个仪器对单个样本进行重复性研究 o再现性 再现性研究评估天与天 操作与操作间的精密度 如果使用多个仪器 要评估仪器与仪器之间的再现性 如果在多个实验室开展检测 也要评估不同实验室间的再现性 O靠近临床cut point和整个分析检测区间内的性能分析的线性 回收率和高剂量钩子效应检出限值和定量限值 在高和低的范围内 分析特异性 交叉反应 干扰 基质效应影响分析结果的分析前因素分析输出 读数区间或阴阳性 临床有效性和临床有用性 临床有效性 检测特性 敏感性 特异性 预测值和拟然比 临床有用性 利用检测结果可以获得有效治疗或其他具体的临床获益筛选有症状个体的检测 基因LRRK2 G2019S突变帕金森症 用于诊断和监控的检测 Heptimax 由QuestDiagnostics研制的实验室自制检测 该检测用于确认活动性丙肝病毒 HCV 感染 监控HCV治疗反应和确认感染的消退 确定预后和指导治疗的检测 OncotypeDX利用实时荧光定量PCR检测乳腺癌肿瘤组织样本中21个基因的表达水平 调整用药剂量的检测 指导华法林剂量的基因检测 基因CYP2C9 编码细胞色素P4502c9 和VKORC1 编码维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1 的多态性 病理说明 1 包括 尸体病理学诊断 细胞病理学检查与诊断 组织病理学检查与诊断 分子病理学技术与诊断 特染和免疫组织化学染色与诊断 电子显微镜技术与诊断 和 其他 项目七个部分 共计53项 检验说明 1 包括 临床血液学检验 临床体液检验 临床化学检验 临床免疫学检验 临床微生物与寄生虫学检验 和 临床分子生物学检验 项目六个部分 共计1104项 2 组织器官移植所需的各项检验 如HLA检查等 列入 临床血液学检验 类的 血型 输血及人类组织相关性抗原检验 类中 3 实验室诊断 中的项目不含静脉采血 需单独收费 但微量采血管 指尖采血 耳垂采血 包含在各检验项目中 不得单独收费 四 分子病理学技术与诊断 BDAA0001组织部 细胞原位杂交检查诊断石蜡包埋组织 新鲜冷冻组织 细胞涂片 组织切片机切片 进行二甲苯脱蜡 系列乙醇水化 微波炉 高压锅及蛋白酶处理 标记探针杂交反应 洗涤 酶或亲和物结合反应 显色 判读结果 含上述过程中所产生的废液 废物的处理 BDAB0001组织部 细胞荧光原位杂交检查诊断荧光素标记探针杂交反应 一种探针 BDAB0002组织部 细胞多色荧光原位杂交检查诊断荧光素标记探针杂交反应 二种或以上探针 BDAB0003组织部 细胞荧光原位杂交技术计量分析诊断荧光素标记探针杂交反应 二种或以上探针 图像定量分析 BDAC0001组织部 细胞原位脱氧核糖核酸 DNA 多聚酶链式反应检查诊断原位PCR反应 亲和物结合 显色 复染 观察 诊断 BDAD0001组织部 细胞原位核糖核酸 RNA 多聚酶链式反应检查诊断原位逆转录PCR反应 亲和物结合 显色 复染 观察 诊断 BDAE0001组织部 细胞荧光定量脱氧核糖核酸 DNA 多聚酶链式反应检查诊断甲醛固定组织 石蜡包埋组织 新鲜或冷冻组织 离心收集细胞 组织粉萃机匀浆化 组织裂解 经反复离心及相应化学试剂去除蛋白 回收DNA 于荧光PCR仪进行荧光素PCR反应 分析结果 诊断 BDAF0001组织部 细胞荧光定量核糖核酸 RNA 多聚酶链式反应检查诊断回收RNA 于于荧光PCR仪进行荧光素逆转录 PCR反应 分析结果 诊断 BDAG0001肿瘤组织脱氧核糖核酸 DNA 测序PCR反应产物琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 产物纯化 测序反应 于DNA测序仪分析 观察结果 诊断 甲醛固定组织 石蜡包埋组织 新鲜或冷冻组织 血液或体液的处理 DNA提取 PCR反应及最后的测序反应纯化 临床分子生物学及细胞遗传学检验 CLAY8000HIV 核糖核酸扩增定量检测CLAZ8000HIV 核糖核酸非扩增定性检测CLBA8000分枝杆菌菌种鉴定CLBB8000结核 非结核分枝杆菌核酸检测CLBC8000巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测CLBD8000巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测CLBE8000多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测CLBF8000多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测CLBG8000EB病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测CLBH8000EB病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测CLBJ8000细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测CLBK8000细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定量检测CLBL8000腺病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测CLBM8000腺病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测CLBN8000淋球菌脱氧核糖核酸扩增检测CLBP8000沙眼衣原体脱氧核糖核酸扩增检测CLBS8000人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸扩增检测CLBT8000人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测CLBU8000人乳头瘤病毒基因分型检测CLBV8000流感病毒核糖核酸检测 1 感染性疾病分子生物学检验CLAA8000病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测CLAB8000病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测CLAC8000病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测CLAD8000病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测CLAE8000病原体核糖核酸扩增定性检测CLAF8000病原体核糖核酸扩增定量检测CLAG8000病原体核糖核酸非扩增定性检测CLAH8000病原体核糖核酸非扩增定性检测CLAJ8000乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测CLAK8000乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测CLAL8000乙型肝炎病毒基因分型检测CLAM8000乙型肝炎病毒C区变异检测CLAN8000乙型肝炎病毒基因变异检测CLAP8000丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测CLAQ8000丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测CLAR8000丙型肝炎病毒基因分型检测CLAS8000丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测CLAT8000丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测CLAV8000戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测CLAW8000庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测CLAX8000HIV 核糖核酸扩增定性检测 疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 CLDA8000染色体核型分析包括外周血染色体等 标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 经培养 收获 制片 染色等步骤 分析染色体核型 审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLDB8000脆性X染色体核型分析 CLDD8000姊妹染色体核型分析CLDF8000肝豆状核变性基因分析CLDG8000血友病基因分析 CLDH8000脆性X综合基因分析CLDJ8000Y染色体性别基因分析CLDK8000脱氧核糖核酸倍体分析CLDL1000血细胞荧光原位杂交分析包括21 13和X Y等染色体 CLDM4000未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析 CLDN8000染色体荧光原位杂交分析CLDP8000羊水细胞染色体分析CLDQ8000绒毛组织染色体分析CLDR8000染色体分析CLDS8000白血病融合基因检测CLDT8000单基因遗传病基因突变检查可检测线粒体基因 a地中海贫血基因 B地中海贫血基因 丙酮酸尿症基因等 标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分析 判断并审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLDU8000遗传性耳聋基因检测可检测GJB基因 SLC26A4基因 GJB3基因 线粒体DNA12SrRNA基因等 标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分析 判断并审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLFA8000乙型肝炎耐药基因检测标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分析 判断并审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLFB8000结核分支杆菌耐药基因检测标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分析 判断并审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLFC8000万古霉素耐药基因检测标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分析 判断并审核结果 录入实验室信息或人工登记 发放报告 按规定处理废弃物 接受临床相关咨询 CLFD8000耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因检测标本类型 各种标本 标本采集 签收 处理 根据标本类型的不同进行相应的前处理 提取基因组DNA 与质控品 阴阳性对照和内参同时扩增 分析扩增产物或杂交或测序等 进行基因分