实验动物胚胎工程药理药效研究动物模型

动物胚胎工程,转基因动物、基因敲除动物和 克隆动物制作的胚胎学基础,管敏强,温州医学院实验动物中心,第一节 动物胚胎工程概述,现代动物胚胎工程是指所有对配子和胚胎进行操作的技术方法，它的研究重点在雌、雄生殖细胞到囊胚的各个发育阶段上实施体外操作技术。,工程之一：胚胎移植工程之二：胚胎培养工程之三： 胚胎保存工程之四： 胚胎分割工程之五： 体外受精工程之六: 显微注射工程之七： 卵的激活与孤雌发育工程之八： 细胞核移植与克隆技术,工程之一 胚胎移植,一、概 述 （一）概念 胚胎移植（embryo transfer，ET）：又称受精卵移植，是将体内或体外生产的哺乳动物早期胚胎移植到同种的生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续妊娠发育为新个体的技术，也称借腹怀胎。 提供胚胎的个体供体（donor） 接受胚胎的个体受体（recipient）,为了使供体多排卵，通常采用超排（superovulation）；国外将常规的胚胎移植称为超数排卵胚胎移植或称为多排卵胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）；目前，用体外生产胚胎（in vitro production, IVP）技术或克隆（cloning）技术等方法也可以生产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低了ET的成本。,二、胚胎移植历史,表1 哺乳动物胚胎生物技术发展主要事件简表,1.1初始阶段1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。1.2初级阶段1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。1.3发展阶段1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%.,1.4实用化初始阶段 1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）.1.5实用化研究阶段 1982- 大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。,三、胚胎移植的意义,科研用途：1.转基因动物、基因敲除动物和克隆动物、核移植、胚胎切割、体外受精等获得目的动物 2.动物的微生物净化 其它用途： 1.稀有品质动物的扩群（如高产奶牛和濒危动物) 2.不孕不育症的治疗(显微受精),四、胚胎移植的生理学基础与基本原则,（一）生理学基础,（二）胚胎移植遵 循的基本原则,（三）开展胚胎移植 的条件,1.胚胎移植的生理学基础,胚胎的遗传特性不受受体雌性动物的影响,,2. 胚胎移植的基本原则,同一解剖位置：空间环境的一致性,同一生理阶段：受体和供体在发情时间上的同期性,同一物种：供体和受体在分类学上的相同属性,胚胎的 质量,胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响。,包括人员的技术水平及所需的设备；,从优良雌性动物获得大量胚胎。,3.开展胚胎移植的条件,五、胚胎移植的基本步骤,供、受体的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植,1.供体和受体的选择,供体应具有相当高的育种价值供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种受体健康状况良好，已进入发情季节供受体发情时间应接近或一致,2. 超数排卵,超数排卵是一种不正常的排卵，经外源激素处理的雌性动物，可以改变性周期，可以超常数的排卵，甚至可以超常数十几倍。在施行小鼠、兔子和金黄地鼠超数排卵研究中，曾有1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只免取得胚胎88枚，有1只金黄地鼠采得72枚胚胎的记录。,超排所用激素主要有三类。第一类是FSH（促卵泡激素）及其类似物，第二类是LH（促黄体激素）及其类似物，第三类是外源性促排卵类激素如GnRH 等类似物，以及这些激素的复合制剂。,超数排卵的意义 采用超数排卵可大大增加每次的排卵数量在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎，可以满足胚胎工程研究、遗传工程研究和建立胚胎库的需要。大大缩短了研究周期在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产量，增加经济效益。,3. 同期发情,利用外源激素制剂或其它生物学手段人为地控制并调整一群雌性动物发情周期的进程，使之在预定的时间内集中发情，以便有计划地合理地组织配种，称为同期发情或同步发情。要想使雌性动物发情，则必须控制P的浓度，即控制黄体的“消”，“长”即是控制母畜发情的关键。 消： 缩短黄体期 PG处理 长： 人为延长黄体期 P处理 利用缩短黄体期的前列腺素或延长黄体期的孕酮,通过缩短和延长黄体期进行同期发情,缩短黄体期（PGF2）,延长黄体期（孕激素）,正常发情周期正常黄体期和卵泡期,大动物如山羊绵羊等动物主要采用前列腺素类的激素如用15-甲基PGF2或氯前列烯醇等激素使黄体溶解来达到同期发情的目的。小型啮齿类动物如小鼠可通过挑选发情母鼠与结扎公鼠交配，来达到同期发情的目的，称为假孕母鼠.,动物的同期发情,定义：利用冲冼液将胚胎从生殖道内冲出，并收集在器皿中。,4.胚胎的收集,胚胎收集的时间：一般在配种后38d，发育至48细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植。,胚胎冲洗液:,冲胚液现多用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）、合成输卵管液（SOF）、布林斯特液等。 冲胚液可加1-5牛血清白蛋白，也可不加；培养液需加入0.1-3.2的牛血清白蛋白，或用1-50犊牛血清代替（用前5630min灭活）,胚胎收集方法:,手术法 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 子宫角冲胚 非手术法 二通管 三通管,5.胚胎的检查与鉴定,胚胎的检查是指在体视镜下从冲卵液回收胚胎。同时检查胚胎的数量和质量。对发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。,胚胎的检查项目： 1、受精卵整体的形态和体积大小； 2、透明带形状，厚度及损伤程度； 3、发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的外形，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚龄一致； 4、卵细胞表面颗粒的状态和多少等。,1（）级：优秀。胚胎细胞团呈均匀对称的球形，单个卵裂球（或细胞）的大小、颜色、密度一致，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段一致。不规则的细胞相对较少。至少有85%的细胞物质是完整的、具有活性的胚胎细胞团。这些判断是以在卵周隙中突出细胞与正常胚胎细胞的百分比为基础的。透明带必须是光滑的而不应是凹陷的或平坦的，否则会使胚胎黏附于培养皿或细管上。 2 （）级：良好。胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞的颜色和密度存在一定的不规则。至少有50%的细胞结构是完好的、具活性的胚胎细胞团。 3 （）级：质差。胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞的颜色和密度存在严重的不规则。至少有25%的细胞结构是完好的、具有活性的胚胎细胞团。 4 （）级：死亡或退化。退化的胚胎、卵母细胞或1细胞胚胎，没有活力。,胚胎质量分级评定标准,6.胚胎的移植,胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物 。,五、胚胎移植存在的主要问题,（一）胚胎来源问题限制了胚胎移植的效率和实际应用（二）我国缺乏熟练操作胚胎移植的技术人员（三）胚胎冷冻保存目前仍存在着诸多问题（四）胚胎移植费用高，人力和时间消费大，条件严格，这也制约了它的推广应用。（五）羊、猪胚胎采集和移植主要采用手术法，不仅易造成粘连，受体重复使用受限制，操作也不方便。,传统的胚胎移植主要由以下一些步骤组成： 1. 超数排卵 2. 同期发情 3. 胚胎收集和预处理 4.胚胎移植,以小鼠为例：,1.结扎公鼠的制备 为了获得同步发情的假孕母鼠，要准备结扎公鼠，通常选用5周龄公鼠做手术，分笼饲养，每笼一只。术后23周即完全康复，可用其生产假孕母鼠。,目的：为了产生同期发情的母鼠,2.超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一般选择在中午注射，间隔48小时后注射HCG，光照周期保持1214h，,将注射HCG后的母鼠与正常公鼠合笼，并于第二天早上检查阴道栓，如果见栓说明已经配上种了，计做怀孕0天。受体母鼠(普通发情母鼠)与结扎公鼠合笼，第二天早上检查阴道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植。,3.同期发情,计算时间,4.胚胎收集和预处理（1）受精卵的收集和处理见栓当日的胚胎处于1细胞期。 以脱颈椎法杀死母鼠，暴露子宫、输卵管；剪下子宫、输卵管，并置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜下撕开壶腹部，释放受精卵并用用新鲜的培养液洗12次。,用透明质酸酶处理受精卵细胞团,（2）28细胞胚胎的收集 交配后2060小时，输卵管中存在有28细胞期胚胎。此时卵丘细胞已经脱掉，可用1ml的注射器自输卵管伞口冲得胚胎。其基本步骤如下：取输卵管，在体视显微镜下找到输卵管伞口，伞口呈平截状，周边略显粗糙。然后，用镊子轻轻夹住伞口下部位，慢慢将冲卵针插入伞口，再用镊子轻轻夹住针头，推压注射器，胚胎从另一端冲出。洗涤胚胎：收集冲得的胚胎，用新鲜的培养液洗12次，转入培养过程。,冲卵,（3）桑葚胚与囊胚的收集 交配后6072小时，一些致密的8细胞胚胎已进入子宫。而桑椹胚和囊胚的收集则一定要从子宫中获得。,5.胚胎移植（1）输卵管移植 根据胚胎数，确定供胚胎移植的受体母鼠数，并做好手术准备。手术切口位于两侧腰部距背正中线1 cm处，左右各一个相互平行的切口。,小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手术剪切开小鼠的皮肤、肌肉、打开腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪垫，并用镊子夹住脂肪组织，把卵巢、输卵管和一部分子宫角慢慢拉出，通过用纱布保护的切口置于纱布上。,在体视显微镜下观察输卵管伞，并用移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可能少带入培养液)。空气泡3、培养液。,（2）子宫移植 麻醉、剪毛、消毒；背部近中线处，最后肋骨水平上，纵向切开皮肤、腹壁，在白色脂肪体上方开一小口剪开腹膜，用钝镊子夹住脂肪体，从切口拉出，继之卵巢、输卵管、子宫相继被拉出，并小心地移入体视显微镜下。,用钝镊子轻轻夹往子宫上端，并用针头其下的子宫壁上扎1小孔。注意不要触及血管。并保证针扎入子宫内腔。轻轻拔出针头，沿该孔将移植管插入约0.5cm，轻轻吹吸管，使培养液后面的气泡达到吸管末端。这时，所有的胚胎就已移入子宫内。子宫、卵巢、输卵管推回腹腔，复位、缝合。,大动物的胚胎移植,工程之二：胚胎培养,胚胎培养就是科学技术人员，在体外仿造类似于体内条件的环境，使胚胎在体外得到与在体内一样的正常发育，这是胚胎工程研究与应用中非常重要的步骤。,胚胎培养,培养开始之前，对实验室和所用的培养器具进行彻底清洗、灭菌、清除可能的残存的细胞毒性物质。 培养液的组成，包括水、无机离子、有机成分、能源物质、pH值、渗透压等对胚胎发育均有很大影响。 现代培养液分为如Whitten氏液、Brinster液、BMOC3和CZB液等简单培养液和TCM199、CMRL 1066、Ham氏液和DMEM液等复杂培养液两类。,胚胎培养方法,即微滴培养法、输卵管培养法和中间受体培养法。 微滴培养法是利用塑料平皿制成50l培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到5CO2、95空气饱和湿度的37.5CO2培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。 输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。 中间受体培养法是指，操作后的胚胎可将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。,胚胎细胞计数法,即空气干燥法和荧光染色法。 空气干燥法是将胚胎放入1柠檬酸钠溶液中低渗1020分钟，尽量少带液体，将胚胎吸到洁净载片上，再用固定液固定。空气干燥后，经Giemsa染色、计数。 荧光染色法可以广泛应用于牛、羊、仓鼠、小鼠、兔子、猪等胚胎计数，常用的染料有Hoechest 33342，复染液为用2.3柠檬酸钠配制的0.1或0.01的台盼蓝（TB）液。,embryo on Day 3 of culture,embryo on Day 5 of culture,工程之三： 胚胎保存,胚胎的保存是指将胚胎在体内或体外正常发育温度下，暂时储存起来而不使其失去活力；或者将其保存于低温或超低温情况下，使细胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，即使其发育处于暂时停顿状态，一旦恢复正常发育温度时，又能再继续发育。,（一）异种活体保存异种活体保存并不是任何一种动物的胚胎都能在另一种动物的输卵管或子宫内存活。实验证明，家兔输卵管比较适于其他动物早期胚胎的保存。 （二）常温保存常温保存是指胚胎在1525温度下于培养液中保存。这种温度下胚胎能保存24h，随时间的延长活力下降，此方法只能做短暂的保存和运输。,（三）低温保存低温保存是指05的区域内保存胚胎的一种方法。此时，胚胎卵裂暂停，代谢速度显著减慢，但尚未停止。这种方法使细胞的某些成分特别是酶处于不稳定状态，保存时间较短。,（四）超低温冷冻保存 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎在-196的条件下停止代谢，而升温后又恢复活力的一种长期保存胚胎的技术。,常用工具：冷冻管,方法：避免形成冰晶，破坏胚胎细胞内结构1.慢速降温法2.快速降温法（1）三步法（2）两步法,保护剂：甘油，1,2-丙二醇，DMSO仪器（慢速冷冻）：大型冻存仪,胚胎冻存的意义：能够使优秀品种品系(包括珍稀和濒危动物)的种质得到长期保存下来，逐步地可以将生物界的所有生命基因长期保存起来，防止基因丢失。并且可以随时复苏、繁殖品系动物，在遗传理论指导下，可改良品种和培育新品种及品系。,工程之四： 胚胎分割,由于发育初期胚胎细胞具有全能性，采用合适的方法把胚胎分成两个或多个部分，每一部分都具有发育成完整个体的能力，为胚胎中单个卵裂球的全能性，培育遗传型相同的动物做了初步探索。,（一）胚胎分割,胚胎分割：运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，从而可获得同孪生后代。,（一）发展史,（二）胚胎分割的基本程序,分割器具的准备,胚 胎 预 处 理,胚 胎 分 割,分割胚的培养,分割胚的保存和移植,体视显微镜,倒置显微镜,显微操作仪,桑椹胚之前的胚胎分割,桑椹胚和囊胚的分割,（二）胚胎切割技术,1.切割器具的准备 胚胎分割需要的器械有体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。 在进行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为2030m。切割针目前有玻璃针和微刀两种，玻璃针一般用实心玻璃拉成，微刀是用锋利的金属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成。,2.胚胎预处理,为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。,3.胚胎分割,在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。,4.分割胚的培养,为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。,5.分割胚胎的保存和移植,胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。 为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。,（三）胚胎分割技术的进展,哺乳动物的胚胎分割技术在近20年取得了较大进展，主要表现为操作方法趋于简化，效率提高。在牛的胚胎移植生产中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的总受胎率和克服异性孪生不育。此外，胚胎分割取样已用于胚胎的性别鉴定和转基因阳性胚胎的早期选择。,应用：1.与核移植相结合，在实验动物方面可以培育出超纯系动物2.对小鼠、家兔、山羊等实验动物胚胎分割后，可以获得同卵孪生后代3.对濒临灭绝的珍惜动物也可以采用这项新技术进行抢救,胚胎分割的方法（1）显微针分割法 该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上作一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入2个预先准备好的空透明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。（2）显微刀分割法 该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。（3）酶软化透明带后显微分割法 用0.5%的链霉蛋白酶软化胚胎透明带, 若是紧密化胚胎(如桑椹胚) , 则需在无钙、镁的平衡盐溶液中处理20 分钟, 使胚胎去紧密化，将胚胎固定，把将针置于欲分割的胚胎上面, 使其与胚胎呈30 度角, 对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。（4）酶消化去透明带后分割法 用0.25%0.5%的链霉蛋白酶去掉胚胎透明带, 然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。（5）徒手分割法 徒手分割法主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。该方法操作简便、快速，便于生产应用，但要求要有较为灵巧的操作技能。,方法： 1. 用玻璃管拉成细丝，再制成切割刀，在显微操作仪的机械手上施行分割或分散胚胎。 2. 如条件较差，可徒手制成玻璃细丝，成为切割刀，在解剖镜下徒手切割。,显微操作仪切割,徒手切割,四.胚胎分割目前存在的问题,1.初生重低 2.遗传一致性不同3.同卵多胎的局限性,归纳小结,工程之五： 体外受精,在实验动物中进行体外受精，一般都着眼与基础理论研究性质，如为受精生物学、发育生物学和繁殖学的基础研究提供实验模型。由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管鼠”、“试管猪”、“试管婴儿”等。,体外受精技术的发展简史,1、 发展简史,1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚学者Austin分别发现了精子获能（cap acitation）现象，使动物体外受精研究进入了新纪元。 1959年张明觉在世界上首先获得了体外受精的的哺乳动物试管兔，推动了体外受精研究工作的开展。 1978年首例人类试管婴儿路易斯布朗（Louise Brown）诞生。,直到20世纪80年代，动物的体外受精技术才取得突破，尤其是牛的体外受精技术发展迅速。 1981年Brackett等用体内成熟卵母细胞获得试管牛犊，随后Hanada等（1985）获得绵羊和山羊体外受精后代，并于1986年获得体外成熟卵母细胞体外受精的第一头犊牛。 我国学者卢克焕（1987）在爱尔兰获得全体外过程的试管牛犊。,（1）研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。 （2）在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。 （3）在人类，IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。 （4）体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。,2、体外受精的意义,试管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)婴儿(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)绵羊(Hanada，1985)猪(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）,3、技术程序,体外受精包括以下步骤：卵母细胞的采集和成熟培养、精子获能、卵母细胞受精和受精后的体外胚胎培养。,(一).卵母细胞的采集和成熟培养,对不同动物,采集卵母细胞的方法不同。 实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等卵细胞的采集： 最常用的方法是卵巢经过 处理，具体做法是给供体注射 ，使一头母畜一次排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子，之后从 中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。,超数排卵,促性腺激素,输卵管,大家畜或大型动物，如牛，卵细胞的采集： 从屠宰场已屠宰母畜的 中采集卵母细胞，也可以借助 、 或 等工具确定卵泡位置，直接从活体动物中吸取泡卵液（连同卵母细胞）取出，在体外进行人工培养，使其成熟。,卵巢,超声波(B超)探测仪,内窥镜,腹腔镜,卵母细胞一般检测,得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、位置和所处的时期。 排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。 多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。 各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为优秀、普通、不良和异常卵。 进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有34层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。,镜检卵母细胞,如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。 如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。,（二）卵母细胞的筛选,只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。,（三）卵母细胞的体外成熟方法,1.成熟培养液的选择 基础培养液TCM199中的核苷、黄嘌呤和次黄嘌呤等对卵母细胞核成熟有抑制作用的成分浓度较低，培养的效果相对较好。 体外成熟培养卵母细胞还要在基础液加入一定浓度的血清（510的FCS或ECS）和促性腺素（0.11.0g/ml FSH和510g /ml LH等）等成分。 2.成熟培养的时间 对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用2224h，但是也要依据动物而定。,3.成熟培养的温度和气相环境 温度：目前，除人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟仍采用37外，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用3839。 气象环境： CO2的浓度：应根据培养液中的碳酸氢盐来定。由于目前培养液中NaHCO3浓度多为2530mmol/L，故一般都采用5的CO2。 4.成熟培养的系统 大致可分为三大类。 开放培养系统： 将12ml成熟培养液直接置于平面皿内或五孔培养板内，然后放入50200枚卵母细胞进行培养，上面不覆盖石蜡油。,微滴培养系统： 将成熟培养液先在组织培养皿中做成50500l的微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。 在一般情况下，这种培养液用在卵母细胞数量特别少的情况下采用。 密闭培养系统： 将卵母细胞置于含有12ml成熟培养液的试管中，加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋内。,(四)体外受精,1.精子的获取 精子来源比较方便，大、中型实验动物，一般通过人工按摩采精或假阴道采精，都能获得成熟的精子，小型实验动物都是通过手术，从驻精囊和输精管内取得成熟的精子。,2.精子的分离与制备是体外受精技术中的一个关键环节,精液中的精子获能抑制因子冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分 影响和干扰受精的完成过多的留在受精液中的死精子, 悬浮法（swim up）： 是筛选高活力精子最为有效的一种方法。 玻璃棉（glasswool）过滤法： 该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大提高精子的受精穿透率。,方法：,精子的获能：刚射出的精子不能穿入卵子，只有在雌性生殖道内度过一段时间之后，才获得受精能力的现象。, BAS/哌可（Percoll）密度梯度离心法： 采用不连续的BSA密度梯度可以分离得到形态正常的高活力精子。 离心洗涤法： 对于精子活力较好的精液可采用直接离心洗涤法制备用于体外受精的精子。,3.精子获能原理,目前精子的获能处理方法主要有：, 与血清白蛋白的溶液长时间孵育： 原理是血清中白蛋白具有很强结合胆固醇和锌离子的能力，可除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。 用高离子强度溶液处理精子： 精子表面的去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液处理精子时，将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 与含有卵泡液的培养液进行孵育： 在培养液中添加一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子获能。, 使用钙离子载体A23187： 直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致精子获能。 使用肝素： 是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接近于体内获能的生理性方法，已经成为动物体外受精应用最广的一种精子获能方法。,精子入卵的三道屏障： 扩展的卵丘 透明带 卵质膜,弱精、畸精、少精症患者的精子很难穿越三道屏障,人为使得精子获能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。,（3）.受精,获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下在 或中完成受精过程。,获能溶液,专用受精溶液,（4）、胚胎的早期培养,概念：是应用人工创造条件，对获取的 进行体外培养。培养液成分：水、无机盐、糖类、维生素、氨基酸、激素