2008 科委面上项目 SNP指导乳腺癌化疗的敏感性研究.doc

天津市自然科学基金申请书_受理号项目类别指南代码（天津市科学技术委员会填写）面上项目N0104 市应用基础研究计划项目申请书项目名称： 药物代谢酶基因多态性指导乳腺癌新辅助化疗的研究 申 请 者： 所在单位： 通讯地址：邮政编码： 电 话： 传 真： 电子信箱： 合作单位： 主管部门： 申请日期： 天津市科学技术委员会二五年印制（VER.6.0）天津市应用基础研究计划项目申请书_ 一、基本信息研究项目项目名称药物代谢酶基因多态性指导乳腺癌新辅助化疗的研究英文名称Study of adjuvant chemotherapeutic treatment of breast cancer directed under genetic polymorphisms of drug-metabolizing enzymes 项目类别面上项目项目性质A.应用基础研究起止年月2007-04至2010-04是否有回避的评审专家无回避的专家技术来源引进消化吸收是否国际、港、澳、台合作项目否项目主要优势社会效益显著产品或技术是否出口否技术领域医药所属工程专项、重大项目名称应用产业领域生物与医药现处阶段应用基础研究前期资助情况指南代码名称肿瘤学 代码N0104 所属学科名称肿瘤治疗学基础 相关学科名称临床药理学 代码C03031906 代码C03020708 关键字乳腺癌 药物遗传学 单核苷酸多态性 新辅助化疗 药物代谢酶主要研究内容（中文摘要）1.药物代谢酶在乳腺癌新辅助化疗中的意义的观察性研究。2.药物代谢酶指导的乳腺癌新辅助化疗的前瞻性研究。预期成果及完成形式（中文摘要）1.确定药物代谢酶相关基因多态性乳腺癌化疗疗效，毒副反应和药物代谢动力学三者之间的关系。2.初步确定利用药物代谢酶基因多态性指导的乳腺癌新辅助化疗的临床用用价值。发表论文5篇，其中12篇被SCI收录，培养硕士研究生2名，博士研究生1名。立项目的（中文摘要）1.确定药物代谢酶基因多态性对药物代谢动力和药物疗效之间的影响。2.确定利用药物代谢酶指导的乳腺癌新辅助化疗的临床用用价值。立项意义（中文摘要）利用药物遗传学手段，指导乳腺癌新辅助化疗的前瞻性研究，为实现乳腺癌规范治疗中的个体化治疗提供新的思路。经 费 预 算 （单位：万元）经费来源预算金额其 中2007年2008年2009年2010年来源合计12822其中国家部委拨款市财政拨款8701区县财政配套主管部门配套单位自筹4121银行贷款其它经费支出预算金额其中市财政拨款计算依据支出合计128其中人员费设备费能源材料费11.08.0DNA纯化，药物浓度测定,SNP分析试验外协费租赁费差旅费会议费0.3参加学术会议国际科技合作经费期初运行费贷款贴息费管理费信息费0.1文献检索，复印其它费用0.6论文发表特别说明：立项依据项目研究的必要性及应用前景（包括项目的研究意义，国内外研究概况、水平存在问题和发展趋势，主要参考文献及出处）。药物代谢相酶 与乳腺癌化疗相关的有谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase ，GST）、UDP-葡萄糖基转移酶（UDP-glucuronyl transferases, UGT）、亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）和胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase, TS）。GST为多种化疗药物的解毒剂，影响ADM、MTX和CTX的疗效和副反应。催化对DNA和脂类有破坏作用的氧离子自由基还原。GST存在、和6种亚型均有高度多态性。GST 基因SNP能预测化疗疗效和化疗不良反应13。缺失或突变的GST可能与环磷酰胺的解毒作减低有关，接受环磷酰胺方案化疗的患者中携带突变型GST（Ile105Val）基因患者比携带野生型GSTA1酶的患者无病生存率高14。在对251名接受CAF联合治疗的妇女的回顾分析中，GSTM1*0和GSTT1*0纯合体性缺失患者比携带野生型基因的患者癌症复发和/ 或死亡率显著降低15。EPI在肝脏特殊通过葡萄糖醛酸转移酶（UGT2B7）形成醛酸化形式是其灭活主要途径，该基因多态性影响表阿霉素的心脏毒性16。MTHFR基因第4外显子C677T 变异导致MTHFR基因活性低，改变细胞内叶酸的分配并导致叶酸潴留以及巯甲基嘌呤造成的严重的毒副反应17。在接受CMF治疗的乳腺癌患者中严重骨髓毒性的发生率与MTHFR C667T改变有关，C677T（A222V）纯合子催化活性低于C667T杂合子，TT基因型的患者可能在CMF方案化疗中更易出现骨髓毒性，出现严重副反应的患者5/6为TT型，而无异常毒性者为20%18。提示对携带MTHFR基因变异患者化疗时应适当减少MTX用量。TS表达增加可能是5-FU耐药机制之一。TSER*2患者TS水平低于TSER*3的患者，因此分析TSER多态性，有助于预测患者对5-FU的反应12。在结肠癌患者中， TSER*2患者在5-FU 治疗后获得分期下降的可能性比TSER*3患者增加3.7倍，TSER*3患者5-FU 治疗反应率为9%，而TSER*2纯合子患者为50% ，且TSER*2患者的生存期有延长的趋势12,19。但TSER*3患者严重副反应发生率较TSER*2患者低。TS增强子基因存在人种差异，国人TSER*2基因型明显少于欧美和南亚人群20；因此将国外临床试验结果应用到国内时，需要注意药物遗传基因的多态性21。目前存在主要问题国内外已有很多研究者注意到药物代谢酶多态性与乳腺癌之间的关系，目前国内外有很多关于药物代谢酶与化疗敏感性的研究，但是目前存在的主要问题是1. 针对白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌的研究较多，而针对与乳腺癌的研究较少22。2. 绝大多数研究仅仅是考虑到某一个或几个基因的多态性与化疗敏感性的关系，或者是研究某一种药物的化疗相关基因，但是临床乳腺癌都是联合化疗的，而与之相关基因有很多，因此乳腺癌化疗需要综合考虑多种相关基因多态性对于乳腺癌化疗敏感的影响5,21。3. 目前多数研究限于实验室，直接临床研究数据较少5,6,13,21,22。4. 目前关于中国人乳腺癌相关药物遗传学数据报道较少21。5. 药物代谢酶相关基因多态性直接用于乳腺癌化疗的前瞻性研究较少,6,9,13,21。未来发展趋势和本次研究的主要目的标准剂量的药物治疗存在着广泛的个体差异性，在临床实践中可能导致治疗效果的个体差异或者出现不良药物反应 5,6,13。因此为每个患者寻找到适合个体的治疗方案是每个临床医生追求的目标，也是目前乳腺癌的研究热点21。寻找与药物不良反应相关的基因变异患者和用于预测药物疗效的生物学标志，始终是分子肿瘤学和肿瘤药理学研究人员不断探索的目标，也是近年来逐渐为人们关注的研究热点 5,14,21。本次研究的主要目的探索将目前药物遗传学领域和肿瘤药理学领域研究较多的，化疗药物代谢酶相关基因多态性与药物代谢之间关系的研究成果5,13,14应用于临床实践。在临床乳腺癌治疗利用SNP分型技术和药物动力学监测，筛选乳腺癌患者药物代谢酶相关基因多态性对乳腺癌化学治疗效果、副反应和生活质量的影响，为利用化疗药物遗传多态性多态性（SNP）指导乳腺癌化疗，选择适合的化疗方案，在提高疗效的同时，降低药物不良反应带来的危险，实现真正意义上的个体化给药探索一条新的思路13。参考文献：1. Dubey S, Siegfried JM, Traynor AM. Non-small-cell lung cancer and breast carcinoma: chemotherapy and beyond.Lancet Oncol. 2006 ;7(5):416-24.2. 沈振宙主编乳腺肿瘤学，上海科技出版社，20043. Nowak AK, Wilcken NR, Stockler MR.et al.Systematic review of taxane-containing versus non-taxane-containing regimens for adjuvant and neoadjuvant treatment of early breast cancer.Lancet Oncol. 2004;5:372-80.4. Henderson IC, Berry DA, Demetri GD.et al.Improved outcomes from addingsequential Paclitaxel but not from escalating Doxorubicin dose in an adjuvantchemotherapy regimen for patients with node-positive primary breast cancer.J Clin Oncol. 2003;21:976-83.5. Ross JS, Symmans WF, Pusztai L, et,al.Pharmacogenomics and clinical biomarkers in drug discovery and development.Am J Clin Pathol. 2005 ;124 Suppl:S29-41.6. Piccart MJ, de Valeriola D, et.al.Adjuvant chemotherapy in 2005: standards and beyond.Breast. 2005 ;14(6):439-45.7. van Schaik RH.Cancer treatment and pharmacogenetics of cytochrome P450 enzymes.Invest New Drugs. 2005 ;23(6):513-228. Topic E, Stefanovic M, Samardzija M. R Association between the CYP2C9 polymorphism and the drug metabolism phenotype.Clin Chem Lab Med. 2004 Jan;42(1):72-89. van Schaik RH. Implications of cytochrome P450 genetic polymorphisms on the toxicity of antitumor agents.Ther Drug Monit. 2004 ;26(2):236-40.10. Baker SD, Sparreboom A, Verweij J.Clinical pharmacokinetics of docetaxel : recent developments.Clin Pharmacokinet. 2006;45:235-52.11. Daly AK. Significance of the minor cytochrome P450 3A isoforms.Clin Pharmacokinet. 2006;45(1):13-31.12. Oguri T, Achiwa H, Bessho Y,et al.The role of thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase in resistance to 5-fluorouracil in human lung cancer cells.Lung Cancer. 2005;49(3):345-51.13. Robert J, Morvan VL, Smith D, Predicting drug response and toxicity based on gene polymorphisms.Crit Rev Oncol Hematol. 2005 ;54(3):171-96.14. DeMichele A, Aplenc R, Botbyl J, et al. Drug-metabolizing enzyme polymorphisms predict clinical outcome in a node-positive breast cancer cohort.J Clin Oncol. 2005 20;23(24):5552-9.15. Dasgupta RK, Adamson PJ, Davies FE, et,al.Polymorphic variation in GSTP1 modulates outcome following therapy for multiple myeloma.Blood. 2003 ;102(7):2345-50. 16. Innocenti F, Iyer L, Ramirez J, et,al.Epirubicin glucuronidation is catalyzed by human UDP-glucuronosyltransferase 2B7.Drug Metab Dispos. 2001 ;29(5):686-92. 17. Shrubsole MJ, Shu XO, Ruan ZX, et,al.MTHFR genotypes and breast cancer survival after surgery and chemotherapy: a report from the Shanghai Breast Cancer Study.Breast Cancer Res Treat. 2005 ;91(1):73-9.18. Sohn KJ, Croxford R, Yates Z, et.al.Effect of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on chemosensitivity of colon and breast cancer cells to 5-fluorouracil and methotrexate.J Natl Cancer Inst. 2004 21;96(2):134-44. 19. Fernandez-Contreras ME, Sanchez-Prudencio S, Sanchez-Hernandez JJ, et,al.Thymidylate synthase expression pattern, expression level and single nucleotide polymorphism are predictors for disease-free survival in patients of colorectal cancer treated with 5-fluorouracil.Int J Oncol. 2006 ;28(5):1303-10. 20. Zhai X, Gao J, Hu Z, et,al.Polymorphisms in thymidylate synthase gene and susceptibility to breast cancer in a Chinese population: a case-control analysis.BMC Cancer. 2006 ;6(1):138 21. 胡胜,臧爱华.药物遗传学与癌症治疗.中国肿瘤.2005,14(2).108-11022. Blackhall FH, Howell S, Newman B. Pharmacogenetics in the management of breast cancer - prospects for individualised treatment.Fam Cancer. 2006;5(2):151-7研究内容、GST1、UGT1A1、UGT2B7、MTHFR技术路线试验2药物代谢酶指导的乳腺癌新辅助化疗的前瞻性研究计划观察60例患者。目标人群是符合入选标准的乳腺癌患者。对入选患者进行药物代谢酶基因SNP分型，根据SNP分型确定化疗方案，试验组采用“SNP指导的方案”，对照组采用常规化疗方案进行化疗。化疗后进行药物代谢动力学监测。观察化疗疗效、副反应。进行药物代谢酶基因SNP分型。由数据处理人员比较两组间的差异。本次研究需要进行下列11个与乳腺癌化疗相关的药物代谢酶基因SNP分型CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP29、CYP219、CYP3A4、CYP3A 5 、GST1、UGT1A1、UGT2B7、MTHFR技术路线SNP指导/常规方案化疗SNP分型分组乳腺癌患者比较两组间差异签署知情同意书受试选择剔除不符合进入研究临床病理资料登记疗效观察副反应观察生活质量调查药代动力学观察符 合拒绝签署研究步骤:（操作流程）所有实验步骤和操作流程均在试验开始之前约定人员分配：本次试验设立专职的评价小组、随机分配小组、数据收集与处理小组、临床指导小组、SNP分型小组、药代动力学检测小组1. 临床评价小组人员：由赵颖副主任医师、葛洁医师组成。职责：1. 接到主诊医生申请后按照预先规定的流程判断是否能够进入试验；2. 每治疗两个周期后重新评价，确定是否有必要删除或者退出；再评价问题：治疗两个周期后开始评价，CR 、PR、SD患者继续治疗至第4个周期；PD患者停止研究；3. 第2、4、6周期的第20天进行治疗效果，副反应（按WHO 推荐的急性和亚急性毒性作用 分级标准）和生活质量（按WHO推荐FACTB调查表进行）评价；4. 每次评价需由两人共同进行并记入事先规定的患者病历报告表（CRF）；5. 在CRF上逐条填写入选/排除/退出/删除标准的具体内容与结论；6. 将填写的CRF数据及时提交数据收集与处理小组。2. 随机分配小组人员：由孙敬岩医师组成。职责：1. 将备选化疗方案编号事先写在白纸上，并封入同样外观的信封中；2. 指导和监督患者随机选取信封并揭示分配的方案编号；3. CRF上记录给予患者被指定的化疗方案编号；4. 通知临床指导小组核实患者分配的方案是否临床合理；5. 试验中严格遵守随机和盲法原则；3. 数据收集与处理小组人员：由钱碧云副研究员及所在我院流行病研究室承担。职责：1. 从评价小组提交的CRF中提取数据并输入计算机；2. 随时随机抽查CRF填写的客观数据指标的准确性，至少抽查10%病例；3. 核实疗效评价、副反应评价、生活质量评价中二级数据的准确性；4. 试验结束后进行数据统计与数据挖掘。4. 临床指导小组人员：由宁连胜主任医师、曹旭晨副主任医师组成。职责：1. 核实患者由随机或SNP指导分配的新辅助化疗方案是否适合该患者，以及该患者是否存在化疗方案的绝对与相对禁忌症；2. 指导管床医生进行患者的常规诊断、治疗处理；3. 指导评价小组进行疑难病例评价与处理。5. SNP分型小组人员：由郑伟教授、张斌主治医师承担。职责：1. 血液标本DNA提取；2. SNP分型操作；3. 向临床指导小组提供SNP分型指导化疗的意见；6. 药代动力学检测小组人员：由闫昭副研究员及其所在我院临床药理基地承担。职责：1. 化疗后，指导并监督管床护士按约定时间和取血方案取血样；2. 血药浓度检测；3. 药物代谢动力学分析；操作流程1.：受试者选择受试者选择具体操作流程如下：取病理无不符合符合签署知情同意书符合符合继续研究退出试验不符合退出标准？不符合删除标准？乳腺癌患者主治医生申请进入研究评价小组进行评价有核实病理诊断符合入选标准？不符合排除标准？每两周期后再评价进入研究操作流程：1. 患者所在治疗组的主诊医生粗评患者是否适合进入试验并向评价小组提出申请；2. 评价小组复习病例，确定见到病理诊断报告；如无病理报告督促管床医生追查病理报告，如为外院所取病理，则需本院乳腺病理科副主任以上会诊并出具病理会诊报告；3. 将患者情况与入选标准、排除标准逐条核实确定患者是否适合进入研究；4. 如患者适合进入研究则与患者签署知情同意书并分配研究编号；5. 评价小组将患者情况详实填入CRF；6. 评价小组两周期化疗后重新评价，确定剔除或者继续研究；入选标准：1. 经组织学或细胞学确诊的可手术乳腺癌患者；2. 既往未接受过任何放疗或化疗方案；3. 仅有一个未治疗过的可测量病灶，直径4.0cm；4. 一般状况KSP评分70分；5. 年龄1860岁；6. 预计化疗后可以进行根治性手术；7. 入组前HGB10g/dl，且WBC4.0109/L且ANC2.0109/L且PLT100.0109/L；无出血倾向；8. 心电图、心肌酶谱未见异常；但孤立的无症状T波低平不是排除标准；9. 肝功能检查ALT和AST在正常上限1.5倍以内，BIL正常无基础肝病；10. 尿常规及肾功能各项指标均在正常范围；11. 符合伦理学要求，受试者自愿，签署知情同意书。排除标准：1. 妊娠或哺乳期乳腺癌患者；2. 活动性感染或其他严重潜在疾病患者；3. 有远处转移患者或者最终不能接受手术患者；4. 在过去的12月内有临床明显的心脏病或者心肌梗死，目前不能控制的高血压；5. 患者有不可控制的癫痫发作、中枢神经系统转移或功能紊乱并且阻碍签署知情同意书或 者不良反应观察或因精神病丧失劳动能力；6. 既往有其他恶性肿瘤病史；7. 治疗前对可测量病灶进行过放疗或者化疗或者内分泌治疗；8. 治疗前参与过任何试验性药物研究，包括中药、气功以及其它顺势疗法；9. 患有活动性消化性溃疡，不稳定糖尿病或者使用糖皮质激素的其它禁忌症；10. 有吸毒等不良药瘾和/或长期嗜酒者；11. 异常钙化是唯一可观察的指标；退出标准：1. 受试者要求退出；2. 试验中发生不良事件；3. 试验中病程进展，不宜继续使用药物和/或不能继续本方案4. 同时使用其他影响疗效判断的的药物；5. 临床资料记录不全；6. 未按研究方案所定的剂量和方法给药；删除标准：1. 误诊误入；乳腺癌以外的乳房恶性疾病；2. 临床资料无记录；或指标记录太少无法最终进行数据处理与统计；操作方案2：盲法随机隐藏分组随机化设计1. 随机化分组由随机分配小组专职负责随机分组；2. 试验开始之前将各化疗方案名称封入同样的信封中，试验时随机抽取方案进行化疗；3. 由临床指导小组评价随机分配的化疗方案是否适合患者，是否存在被分配方案的绝对和相对禁忌症；4. 如果患者存在被分配方案的禁忌症，则重新新入随机化程序。事先约定化疗方案封入外观一样的信封进入试验的患者随机分配小组登记随机抽取信封分配化疗方案临床指导小组复核方案禁忌？无禁忌将方案告知主诊医生有方案禁忌重新分配方案5. 如果患者不存在被分配方案的禁忌症，适合化疗方案，则由临床指导小组直接通知患者所在治疗组主诊医生。盲法设计采用双盲双模拟法进行盲法设计，研究中的每一种药均设模拟剂，即每一例患者的输液方案外观完全一样，但每组液体中按试验要求给入化疗药物或者盐水模拟。隐藏设计通过试验设计分配的化疗方案由临床指导小组直接通知患者所在治疗组主诊医生，由主诊医生下达医嘱，由主班护士转抄医著并下达至静脉输液配制中心，配制成外观统一的静脉输液剂，统一由主管护士经由PICC或锁穿管中直接输入患者中心静脉。评价小组和数据处理小组不知道患者使用的化疗方案。进入试验的患者随机分配小组分组临床指导小组复核通知主诊医师下达医嘱主班护士转抄医嘱配液中心配液统一外观静脉输液剂送入病房经PICC或锁穿输液操作方案3：药物代谢酶基因SNP指导的化疗1.主诊医生将患者情况报告给临床指导小组2.由临床指导小组根据患者的具体情况，参考乳腺肿瘤学（沈震宙主编，上海科技出版社，2005年）和NCCN乳腺癌治疗指南确定根据目前诊疗常规可供选择的化疗方案；3.由SNP分型小组根据患者的SNP分型情况提出参考意见。4.临床指导小组根据SNP分型小组的参考意见将可选择的化疗方案分为“SNP指导下的化疗方案”和不受SNP指导的“常规化疗方案”，试验组采用“SNP指导下的化疗方案，对照组采用“常规化疗方案”。“SNP提倡的化疗方案”目前可以参考的规则有：u 携带CYP3A4/5患者：TAX/DOC清除率降低，副反应增加，避免使用TAX/DOC；u 携带CYP2C8患者：TAX清除率降低，副反应增加，避免使用TAX； DOC不影响；u 携带DPYD*2患者：对5-FU有强烈副反应，避免使用；u 携带GSTM1*0缺失患者：ADM、MTX和CTX有较好的疗效和较强副反应；u 携带UGT2B7患者：EPI的心肌毒性较低，应使用EPI；其余类型则心肌毒性较高；u 携带MTHFR C667T患者：MTX容易引发严重骨髓抑制，避免应用；u 携带TSER*2患者：5-Fu治疗效果和毒副反应均较强；补充规则主要由试验1得到的结论进行补充。操作方案4： 化疗方案化疗药物药物： 环磷酰胺注射剂 CTX 500 mg/m2 i.v. D1 阿霉素注射剂 ADM 50 mg/m2i.v. D1表阿霉素注射剂 EPI70 mg/ m2 i.v. D1 5-氟尿嘧啶注射剂 5-Fu 500 mg/m2 i.v. D1 紫杉醇注射剂 TAX 135 mg/m2 i.v. D2 多烯紫杉醇注射剂 DOX 70 mg/m2 i.v. D2甲氨喋呤 MTX 40 mg/m2i.v. D1按体表面积计算药量，体表面积如果大于2.0，按2.0计算，药物的实际使用剂量按可计算面积的15%给予。联合化疗方案：本次研究使用新辅助化疗方案均按乳腺肿瘤学（沈震宙主编，上海科技出版社，2005年）和NCCN乳腺癌治疗指南中规定的化疗方案进行。1.CAF 方案 每21天一个疗程。2.CMF 方案 每21天一个疗程。3.CA 方案 每21天一个疗程。4.CAT 方案 每21天一个疗程。5.AT 方案 每21天一个疗程。其中A：ADM或者EPI T：TAX或者DOX对症处理及伴随用药：1. 化疗过程中根据患者需要进行水化；2. 按照以下方案进行止吐处理托烷司琼 5mg i.v. 化疗前30min 给予, D1。3. 如果24小时内恶心呕吐5次，可追加托烷司琼一次，若24小时以后恶心呕吐明显，可 酌情使用地塞米松、胃复安、非那根、苯海拉明、安定等处理。4. 在输注紫杉类和阿霉素药物同时使用心电监护。5. 入选病例在第一周期均不能预防使用细胞生长因子（rhG-CSF、rhGM-CSF、EPO和IL-11）。但前一周出新IV度和或中性粒细胞减少性发热，则下一周期可预防使用细胞生长因子rhG-CSF、rhGM-CSF。6. 治疗周期中血小板20109/L或出现出血倾向时；可输注血小板，当血小板50109/L时，可给予IL-11治疗。操作方案5：疗效观察方案1. 由临床评价小组每2周期的第20日独立完成。2. 临床评价小组在CRF中详细记录治疗效果的治疗客观效果指标并给予评定。客观效果指标：1. 客观病灶测量：包括BUS、钼靶、CT或者MRI检查；2. 与疗效评价有关的检查应于治疗前两周内完成。每两周期评价一次疗效，影像学检查安排在每两个周期的第20天。3. 疗效评定应按WHO标准进行。治疗效果评定：1. 按照WHO实体瘤客观疗效标准分为CR、PR、SD、PD，有效率（RR）为CR+PR率，需2位临床医生观察确定。客观疗效评价标准完全缓解（CR）：可见病灶完全消失，至少维持4周以上；部分缓解（PR）：肿瘤病灶的最大直径以及最大垂直直径的乘积减少50%以上，并维持4周以上；稳 定（SD）：肿瘤病灶的最大直径以及最大直径的垂直乘积缩小小于25%或者增大小于25%，无新病灶出现；病变进展（PD）：肿瘤病灶的最大直径以及最大直径的垂直乘积缩增大大于25%，或有新病灶出现；总缓解率（RR）：（CR+PR）%病情进展（PD）：与治疗或其它医学措施无关的病情恶化。其标准为所选病灶增大25%或出现新的病灶。如果患者出现新发转移灶则列为病情进展。一般在进入研究6周以后评价病情进展。2. 每2个周期评价疗效，CR 、PR、SD患者继续治疗至第4个周期；PD患者退出研究。3. PR和CR患者4周期后重复检查确定疗效。以病例治疗后达到的能维持4周以上的最佳疗效（Best Response,BR）进行统计总结。操作方案6：不良反应观察方案1. 由临床评价小组每2周期评价疗效同时独立完成。2. 按WHO关于不良事件的评价标准分为0、I、II、III、IV度；（见附表）3. 主管医生随时向评价小组报告不良反应发生情况，临床评价小组在CRF中详细记录临床试验期间患者的主诉的任何不适感或客观的异常改变。操作方案7：生活质量调查方案1. 由临床评价小组独立完成并在CRF中详细记录；2. 采用WHO推荐的乳腺癌专用生活质量调查用表（FACT-B）进行调查（见附表）；3. 在每2周期评价疗效同时由患者独立亲自填写FACT-B调查问卷；4. 由数据收集与处理小组进行调查问卷的数据处理。操作方案8：安全性保障操作方案1. 由患者所在治疗小组的主诊医生和主治医生进行评价并承担相应医疗负责；2. 一般体检项目：体力状况评分、体重、体表面积等，研究开始前进行；3. 外周血常规检查至少每个化疗周期一次，尿便常规在每个化疗周期前进行一次；4. 心电图、肝肾功能、血糖及电解质等系列检查应在每个化疗周期前各进行一次，研结束时进行一次。若化疗期间出现异常每周至少复查一次，直至正常为止。心肌酶谱在第一周期前及研究后各进行一次，治疗中若心电图有异常或主管医生有必要可以随时进行。若化疗延期1周以上，则应进行一次以上指标的检查。操作方案9：样本采集方案1. 由管床护士在负责采血；2. 采血基本操作流程按基础护理学的基本要求进行；3. 采用BD公司生产的双针负压自动采血管进行静脉采血；4. 按BD自动采血管要求取3ml全血；5. 不得用注射器直接采血；不得从留置针或PICC或锁穿管中直接取血；6. 采血部位统一为头静脉、贵要静脉或肘正中静脉；不采用其他部位血管或者指血； 7. 在采血管标签上填写患者姓名、住院号、时间并立即置于4冰箱中冷藏；操作方案10：基因组DNA提取纯化由SNP分型小组负责在采血当日完成。采用Promega ReadyAmpTM Genomic DNA Purification System 试剂按附带说明书进行。1. 先在 1.5m1的灭菌离心管中装入900l RBC Lysis Solution,加入300l全血，混和均匀，于室温下孵育3-10分钟（在此期间翻转离心管10次以上）。冻存血样DNA抽提时，需将冻存血样于37水浴2分钟充分溶解后立即置于冰上，以确保DNA的完整性及得率。对于新鲜抽取的血样可以适当延长孵育时间至10分钟；2. 15000g离心30秒，小心移弃上清液，留下可见的白细胞沉淀层和1020l的残液。于涡旋混合器上猛烈振荡离心管约10秒钟，确保残液中的白细胞沉淀层充分悬浮；3. 加入300l Cell LysisSolution至悬浮细胞中，快速振荡离心管20秒以上，以充分裂解细胞，室温放置510分钟；4. 加入100l Protein Precipitation Solution，于涡旋混合器上猛烈振荡离心管30秒以上，使溶液充分混匀；5. 15000g离心5分钟，此时会出现深褐色的致密块状蛋白沉淀物，将含有DNA的上清液移入一个灭菌的1.5m1离心管中；6. 加 入 300l 100%的异丙醇。轻柔翻转离心管约50次，混合样品；7. 15000g离心1分钟，此时DNA在离心管的底部形成肉眼可见的白色点状沉淀；8. 仔 细 弃 净 上清液，加入300l 70%乙醇，翻转试管数次，以充分洗净DNA层；9. 15000g离心1分钟，仔细弃净乙醇。于空气中放置至乙醇完全挥发，注意不要使沉淀过于干燥，以免DNA难以溶解；10. 加入100l DNAHydration Solution溶解沉淀，可以置于65水浴5分钟以加速溶解；11. 紫外分光光度计鉴定纯度和浓度；12. 置于-80冰箱冷冻保存。操作方案11：SNP分析从我们的合作者，本次研究的第二申请人，美国VanderbiltUniversity郑伟教授提供引物与探针（申请书中未显示引物与探针的序列）。采用美国Applied Biosystems公司的TaqMan基因分型系统进行分析。由SNP分型小组负责完成。本次研究需要进行下列11个与乳腺癌化疗相关的药物代谢酶基因SNP分型：CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP29、CYP219、CYP3A4、CYP3A 5 、GST1、UGT1A1、UGT2B7、MTHFR1. 配制Master Mix，各试剂的终浓度见ABI TagMan Universal mastermix;Porbe终浓度250nM, prime终浓度900nM.每次检测至少设置3个NTC( No Template Control).配制Master Mix Preparation（12次用）组份体积最终浓度10 Taqman Bufer A60L125 mM MgCl2 Solution84L3.5mMdNTP (each)12L200MAmpliTaq Gold DNA Polymerase(5 U /L)3L0.025U/ LAmpEraseU NG( 1U/ L)6L0.01 U/ LDeionized water207LTotal Mix408L2. 配置PCR反应体系组份体积最终浓度2TaqMan Master Mix10L1引物（200pmol /L）0.9L900nM探针0.5L250nM模板DNA(20ng/L)1Lng/LDeionized water6.2LTotal Mix20L3.4.5. PCR循环条件 50, 2min50, 2min50, 2min50, 2min456. 把加好样品的孔板PCR放在PCR仪上进行反应，反应完毕后进行最终荧光采集信号的读板工作，操作方案12： 药物代谢浓度检测由药代动力学检测小组负责在采血后2小时之内完成。采用高效液相色谱法检测1. 多烯紫杉醇基本检测条件为：HPLC-UV系统，C18 色谱分析柱，流动相为甲醇-水流动相：乙腈水（5050，VV）；柱温：室温；紫外检测波长230 nm；2. 紫杉醇基本检测条件为：HPLC-UV系统，C18 色谱分析柱，流动相为甲醇-水(65:35，v/v)；流速1mL/min,柱温为30；紫外检测波长为227 nm；灵敏度0.002 AU FS。3. 阿霉素基本检测条件为：HPLC- FU系统，C18色谱分析柱，流动相为5 mmol磷酸甲醇，流速1 mL/min；荧光检测激发波长450nm，发射波长530nm；柱温为室温。4. 表阿霉素基本检测条件为：HPLC- FU系统，C18色谱分析柱，流动相为30%乙腈和7甲酸胺，流速2 mL/min；紫外检测波长254 nm；灵敏度为0.02AUFS5. 氨甲喋呤基本检测条件为：HPLC- FU系统，C18色谱分析柱，流动相：甲醇0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(30:100)；流速：0.8ml/min；检测波长：306nm；灵敏度：0.01 AUFS6. 色谱条件：色谱柱：Kromasil C18 色谱柱（4.6 mm200 mm, 5 m）；流动相：乙腈-水 (1:99,)；流速：0.9 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：室温。可行性分析1. 理论可行性本次研究的目的是考察药物代谢酶基因多态性对乳腺癌新辅助化疗中药物代谢动力学、化疗效果和副反应之间的关系，所依托的理论基础牢固。本次研究讨论的药物代谢酶在动物实验中已经有证实，在其他研究中对单一基因也有类似研究，本次研究是参照以往研究，探讨乳腺癌新辅助化疗中多种代谢酶基因多态性对联合化疗效果的影响。从理论上讲是可行的。2. 技术可行性临床方面：申请者所在的天津医科大学肿瘤医院乳腺肿瘤科是全国历史最早、规模最大的乳腺癌研究中心，乳腺癌治疗有着历史的优势。每年有初诊乳腺癌2200余例，病源充足，可供选择和研究。并且本研究依托的科室具有乳腺肿瘤专科高级职称专业技术人员30余名，为本次研究提供强大的临床技术支持。SNP分型方面：合作者美国VanderbiltUniversity肿瘤中心，分子流行病研究室郑伟教授多年致力于药物代谢酶基因多态性与乳腺癌病因学之间的关系，对药物代谢酶基因SNP分型熟悉，曾发表SCI文章30余篇（简历和相关研究论文见附件）。郑伟教授为本次研究提供技术支持，并提供本次研究所需引物与探针并签署合作协议。药代动力学检测方面：我院国家药品临床研究基地具备开展新药人体药代动力学的资质和条件，完成过多项国家级抗肿瘤新药的人体药代动力学研究工作，如1.1类新药9-硝基喜树碱、人参三醇、重组人血管内皮抑素，3.1类新药雷替曲赛、复方替加氟奥替拉西等。本研究中各种化疗药物已在临床应用多年，其血药浓度测定方法成熟。3. 设备可行天津医科大学肿瘤医院乳腺癌防治研究中心作为亚洲最大的乳腺癌防治研究中心，拥有乳腺癌患者诊察所需钼靶、B超，并设有专门的静脉液体配制中心；申请者所在天津医科大学肿瘤学科为教育部重点学科，目前拥有教育部乳腺癌防治研究重点实验室，教育部211工程建设肿瘤学重点实验室，肿瘤防治天津市重点实验室。目前已经具备本次研究所需实验仪器设备及技术人员配备。SNP分型和血药浓度检测所需仪器设备均已具备，包括LabAlliance高效液相色谱仪（包括LabAlliance PC3000HPLC System 、Model 500型UV检测器、Model305型FU检测器）；Kromasil色谱柱(C18，5，2504.6 mm)；固相萃取柱(C18，500mg，1mL)；SHIMADZUUV-2501PC紫外扫描仪； Biofuge Stratos冷冻高速离心机；BRANSON 3510超声波震荡仪；Sartorius电子天平；扫描仪； Biofuge Stratos冷冻高速离心机；BRANSON 3510超声波震荡仪；AMI 9700