检验基因治疗

1,Gene therapy,基因治疗,2,传统疗法与基因治疗,传统治疗方法药物治疗手术治疗放射治疗理疗新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy),3,Gene Therapy,什么是基因治疗？怎样进行基因治疗 ?基因治疗存在哪些问题?,4,基因治疗的概念：,经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念：将某种遗传物质转移至患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗疾病的目的，均称之为基因治疗。,5,1、遗传病（Inherited disorders）：ADA缺陷的严重联合免疫缺陷症（SCID）,血友病，家族性高胆固醇血症，囊性纤维变性，Gaucher症等2、恶性肿瘤：恶性黑色素瘤，成神经细胞瘤，白血病，肾癌，卵巢癌等3、感染性疾病（Infectious diseases）：艾滋病4、其它：血管病,etc,What can gene therapy be applied to?,Statistic of gene therapy protocols and patients,7,基因治疗的必要条件,发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作,8,治疗什么病？增强而非治疗将被否定目前还有什么其它疗法？治疗的安全性如何？个人、家人、环境对该患者的疗效如何？公正的选择受治疗的患者？知情同意原则保护患者的隐私权,采取基因治疗前应考虑的问题,9,Martin Cline 事件,M.Cline是加州大学洛杉矶分校的血液学科主任1980年企图用基因疗法来治疗两名重型地中海型贫血的欧洲病人。试图将正常珠蛋白基因插入患者骨髓的祖细胞中，以改善贫血和反复输血导致的铁超负荷因为使用重组的珠蛋白基因，没有按照规定的天然的珠蛋白基因，被加州大学的（human subjects protection committee)终止该项工作，并被NIH终止其获得的两项科研基金。,10,基因治疗的几种策略,原位修复有缺陷的基因，使其在质和量上均能得到正常表达基因替代疗法，即传统上的基因治疗重新开放已关闭的基因，目的在于促使有类似功能的基因表达基因抑制，导入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻断有害基因的表达基因封闭，主要是指反义RNA，并被誉为“基因封条”引入特定基因以提高免疫力，向TIL细胞导入TNF、IL-2、干扰素等,11,基因治疗的内容,治疗基因的选择：缺陷对应基因；治疗意义基因靶细胞的选择：生殖细胞；体细胞（淋巴细胞、骨髓细胞等）治疗基因导入靶细胞的载体：病毒载体；非病毒载体导入基因的方式：ex vivo；in vivo基因治疗的方案：基因矫正或置换；基因增补；基因灭活；导入非特异性基因,12,基 本 步 骤,治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移治疗基因在靶细胞中的正确表达回输体内,13,14,（一）.治疗性基因的选择,在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害；在抗病毒和病原体的基因治疗中，选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的.肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。,15,特异正常基因的分离与克隆,应用重组DNA和分子克隆技术，许多人类基因被分离和克隆，这是基因治疗的前提。在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有基因探针和准确的基因定位，任何基因都可被克隆。,16,此外，现在既可人工合成DNA探针，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因，这些都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。,17,（二）.载体的选择,理想的基因转移载体条件：高转移频率；容量大；高滴度；外源基因稳定表达；靶向性；安全性高,18,载体的种类,病毒载体：逆转录病毒（RV）、腺病毒（AV)、腺相关的病毒(AAV)、疱疹病毒和肝炎病毒等。非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体( liposome ) 。,19,几种常用的病毒载体,逆转录病毒载体8.5kb腺病毒载体36kb腺相关病毒载体5kb,20,21,逆 转 录 病 毒 的 生 活 史,将病毒RNA包装成病毒颗粒,逆转录病毒,结合细胞表面,将RNA注入细胞质,逆转录合成前病毒,整合到靶细胞染色体上,合成病毒RNA合成病毒蛋白质病毒外壳蛋白质,以出芽的方式从宿主细胞中分泌出来,22,逆 转 录 病 毒 的 基 因 结 构,与病毒复制相关的基因位点 gag：编码病毒核心蛋白 pol：编码逆转录酶 env：编码外壳蛋白,与病毒整合包装相关的基因位点 LTR：启动子与增强子等 PB，PB：引物结合位点 位点：病毒RNA包装成病毒颗粒所必须（区）,24,在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼( Moloney ) 鼠白血病病毒 ( moloney leukemia virus； Mo MLV ),U3 R U5,U3 R U5,gag pol env,LTR,LTR,LTR：长末端顺序，内含启动子、增强子及有关调节顺序gag：病毒核心抗原基因； env: 病毒外壳蛋白基因pol：反转录酶基因,25,逆转录病毒载体的优点,1. 插入的片段可长达7kb2. 基因转移效率高，近100，但必须是正在分裂的细胞3. 可整合宿主染色体，外源基因可以稳定表达，并随细胞分裂而传代4. 宿主范围广5. 比较安全,26,逆转录病毒载体的缺点,要求靶细胞DNA合成很活跃，因为病毒的感染和插入作用均依赖于靶细胞DNA的复制靶细胞表面需要有特殊的受体必须应用带有缺陷逆转录病毒基因组的细胞（包装细胞）滴度低整合入宿主为随机性，有致突变可能,腺病毒载体（AV）,腺病毒最早是从腺样组织分离出来。其对淋巴腺有亲和力，可以在淋巴腺中潜伏很久。可以侵入呼吸道、肠道、结膜，在呼吸道中可以引起呼吸道的各种发炎腺病毒载体为无包膜的双链DNA病毒，基因组为36kb，了解清楚。4型与7型应用多年，证实对人体无害AV有较大的宿主范围，可以感染非分裂细胞，在in vivo的基因转移上优势较大AV感染细胞时其DNA不整合到宿主的染色体上，无潜在的致癌危险,28,腺病毒赖氨酸DNA复合体,29,病毒载体,病毒DNA,病毒DNA,有功能的人类基因,病人,病人细胞培养,人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中感染细胞，经过培养后再输入病人体内进行治疗模式图,30,腺病毒载体的优缺点,优点：滴度高可插入8kb的源DNA片段可用于体内基因直接转移缺点：不能整合，只能瞬时表达，遗传病不能应用在体内存在复制的可能性，安全性值得注意,31,腺相关病毒（AAV）,是目前已知的动物病毒中最简单的一类单链线状DNA病毒基因组仅5kb，包含3个启动子和2个基因本身是缺陷型基因，需要辅助病毒如腺病毒或痘苗病毒的存在才能进行有效的复制和感染,32,腺相关病毒优缺点：,优点：原病毒对人没有致病性能整合到染色体上的特殊位点，减少插入突变的可能性能整合非分裂细胞外源基因表达稳定缺点：不能插入大于3.5kb的外源片段包装时需要辅助病毒滴度低,33,非病毒法转移目的基因,显微注射法磷酸钙共沉淀法微粒轰击法脂质体法细胞受体介导的基因转移技术,34,35,（三）靶细胞的选择,方便从体内取出，且方便植回体内。在体外能用常规方法大量繁殖。现有的基因转移技术能高效地将外源基因植入。植入体内后，能高效持久的表达外源基因。,36,生殖细胞（germ-line cell）体细胞（somatic cell）体细胞基因治疗的发展较生殖细胞的基因治疗的发展更为成熟生殖细胞基因治疗对绝大多数隐性遗传性疾病的根治具有重要意义，关键在于基因生殖细胞的识别和鉴定。,常用的靶细胞,37,常用的靶细胞,淋巴细胞：回输后体内寿命不长造血干细胞：转移效率与体内表达不高成纤维细胞：治疗血友病B肌肉细胞：直接的体内基因转移肝细胞：内皮细胞与肿瘤细胞等,38,（四）基因转移,非病毒介导的基因转移：- 显微注射、电穿孔、DNA直接注射、基因枪- 磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体法病毒介导的基因转移：- 转染,39, 显微注射法,用特殊的显微注射器将表达质粒直接注射入细胞中而使之得以表达，转化效率低，约为110%,为暂时性表达。溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS,40,将目的基因在Cacl2和Na2HPO4存在的条件下，形成DNA-Ca3(PO4)2沉淀混合物，通过细胞的吞饮作用进入细胞，本法只能用于体外基因转移。,磷酸钙共沉淀法,41,脂质体 (liposomes),42,脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。,43,人工脂质体膜具有如下特点：,与体细胞相容，无毒性和免疫原性可生物降解，不会在体内堆积可制成球状(0.0350 m)，包容大小不同的生物活性分子可带有不同的电荷具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求,44,外源基因的筛检,抗性筛选方法：同源重组 -重组载体上插入有标记基因NeoR（新霉素磷酸转移酶基因），导入受体细胞后可使其产生对G418（Geneticin，氨基糖苷类抗生素）药物的抗性。在加入G418的培养基中进行选择性培养时，转染NeoR基因的细胞能够存活，而未转染的细胞则死亡；应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。,45,（五）外源基因表达的鉴定：,-采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达-测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。,46,静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。,（六）回输体内的方式,47,基因治疗的基本步骤,选择治疗性基因选择基因载体选择靶细胞转移基因在靶细胞中正确表达治疗基因回输体内,48,基 因 治 疗 的 应用,遗传病：基因增补，导入正常基因肿瘤：基因的补充和修复（基因增补、基因矫正），免疫疗法，细胞毒基因疗法（自杀基因）等病毒性疾病：阻断病毒基因在体内的转录和翻译（基因失活）,49,遗传性疾病的基因治疗,50,例：苯丙酮尿症的基因治疗,51,苯丙酮酸尿症 I 型,病因：体内的苯丙氨酸羟化酶缺乏。主征：智力低下，尿有霉味或鼠尿味诊断：血中苯丙氨酸增高(20mg/ml)，尿中苯丙氨酸、苯丙酮酸增高治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮食控制血中苯丙氨酸浓度在3-10mg/ml，持续时间至少至6-8岁,52,治疗性基因：苯丙氨酸羟化酶（PAH）载体：逆转录病毒；腺病毒（Fang B,1994）靶细胞：肝细胞（Fang B,1994）；T淋巴细胞（Lin CM,1997） - 自体细胞；同种异体细胞动物模型：鼠、兔、狗（PAH缺陷）临床实验效果评价：以鼠（PAH-）为模型的实验证实，只要鼠肝中PAH的活性达到正常水平的10%-20%，就足以使血清中苯丙氨酸的水平恢复正常。,苯丙酮尿症的基因治疗,53,哪些遗传病是基因治疗的对象？,对致病基因有详细地了解，并已获得该基因主要以单基因缺损为主只要表达较少量原来缺乏的基因产物就能矫正疾病导入的基因过量表达，对机体无不良作用,54,基因治疗在遗传病中的实际应用,腺苷酸脱氨酶缺陷的严重联合型免疫缺陷症（SCID）（T淋巴细胞）家族性高胆固醇血症（肝细胞）囊性纤维变性（腺病毒载体）Gaucher症血友病（成纤维细胞）,55,血友病的基因治疗,血友病是X染色体连锁遗传性出血性遗传病，甲型、乙型血友病分别由凝血因子与的缺陷引起。动物实验：复旦大学，反转录病毒携带因子兔子皮肤成纤维细胞，筛选后，包埋回兔子体内，可检测到血浆中的因子蛋白，持续1年以上。1991年12月3日，复旦大学遗传所与二军大长海医院，对两例血友病乙型进行基因治疗。临床出血症状明显改善。,56,肿瘤的基因治疗,57,城市居民死因排序：1.恶性肿瘤139.28/10万；2.脑血管病137.72/10万；3.心脏病106.58/10万；4.呼吸系统疾病86.84/10万；5.损伤和中毒38.73/10万；6.消化系统疾病18.65/10万。农村居民死因排序：1.呼吸系统疾病142.06/10万；2.脑血疾病113.05/10万；3.恶性肿瘤105.57/10万；4.心脏病80.07/10万；5.损伤和中毒69.22/10万；6.消化系统疾病24.80/10万.,1998年我国居民十大死因排序,58,癌症治本之疗法,传统的癌症治疗方法，不外乎外科手术、放射线治疗、化学治疗等，都只能治标，不能治本。基本上，一个人要_与_这两种基因同时发生损害时，才会产生癌症。肿瘤细胞多是由基因突变、失落、转移或扩增引起的。基因改变是肿瘤产生的根本原因，所以基因治疗是治疗肿瘤的根本疗法。,59,癌基因的了解,癌基因(oncogene)又名转化基因，是人类或其它动物细胞以及致癌病毒基因组中固有的一类基因，一旦激活能促使人和动物的正常细胞发生癌变在致癌病毒基因组中存在的癌基因称为病毒癌基因（viral oncogene 或v-onc）在人类或其它动物基因组中存在的癌基因称为细胞癌基因（cellular oncogene或c-onc）或原癌基因(proto-oncogene)。,60,癌基因的分类,生长因子类癌基因：sis癌基因生长因子受体类癌基因：KIT癌基因非受体蛋白质酪氨酸激酶癌基因：RET癌基因细胞质蛋白质激酶类癌基因：PIM1癌基因G蛋白质类癌基因：RAS家族核结合蛋白癌基因：EST家族、JUN家族,61,癌基因的协同作用,一个癌基因不能使细胞癌变多数细胞癌变需要2个癌基因先后表达一种肿瘤中有多个癌基因表达,62,肿瘤的基因治疗策略,1.肿瘤的细胞因子基因疗法2.肿瘤的抑癌基因疗法3.反义基因疗法 4.共刺激分子基因疗法5.肿瘤的自杀基因疗法6.多药耐药基因疗法7.肿瘤的MHC基因治疗,63,肿瘤的细胞因子基因疗法,免疫效应细胞介导的细胞因子疗法原理是将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强TIL、LAK、CTL等肿瘤细胞介导的细胞因子疗法将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中，制备出免疫原性更强的新型瘤苗，以激发机体产生显著的抗肿瘤功能几乎所有的细胞因子：IL-1IL-12、G-CSF、M-CSF、TNF细胞因子的直接体内疗法将包含细胞因子基因的表达载体，直接体内注射，经机体的细胞摄取后，可在体内表达,64,TIL细胞介导的细胞因子基因治疗,第一个被美国重组DNA顾问委员会和FDA批准的肿瘤基因治疗计划NIH的Rosengerg教授以细胞因子（TNF或IL-2)基因转导TIL细胞治疗晚期恶性黑色素瘤患者总结了50例转移恶性黑色素瘤患者经TIL细胞配合IL 2治疗的效果，客观消退率为38%。但实际临床效果并不十分满意，修饰过的TIL细胞很难定位到达肿瘤部位，大部分分布在肝脾。TNF的表达也达不到治疗水平。,65,抑癌基因疗法应用,抑癌基因疗法有二：利用抑癌基因疗法治疗已发生的肿瘤利用抑癌基因疗法防止肿瘤的转移Rb基因：视网膜母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等P53基因：人类肿瘤相关性最高的基因50%的人类肿瘤均可检测到P53基因的突变结肠癌细胞、T淋巴细胞白血病野生型P53基因的替代疗法突变型P53基因的阻断疗法与P53基因有关的新型肿瘤疫苗的研究MTS基因：75%肿瘤与之有相关性；P16蛋白抑制肿瘤发生Nm23基因：抑制肿瘤转移的基因,66,反义基因（核酸）疗法,多应用于抗肿瘤和抗病毒感染治疗抗肿瘤疗法：应用反义基因在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内异常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡抗病毒感染：用反义DNA或反义RNA来阻断DNA的复制、转录和翻译，从而达到抗病毒的目的,67,反义基因的种类,人工合成的寡脱氧核苷酸，进入机体后以胞吞的方式进入细胞，直接结合到DNA双链的特定部位，形成三聚体，影响转录因子的结合，使转录不能启动反义基因连接到特定的表达载体上，导入靶细胞后，直接转录出反义RNA，与相应的mRNA形成双链，阻断翻译过程第三种是核酶（ribozyme)，具有催化活性的反义基因，其与相应的mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解,68,反义核酸在应用中的问题,肿瘤是多基因改变导致的结果单一癌基因的阻断并不能完全抑制或逆转肿瘤的生长反义核酸在机体内的特异性或靶向性担心对靶基因周围的细胞产生非特异性阻断反义寡聚物的代谢体内迅速失活成为亟待解决的问题,69,肿瘤的自杀基因疗法,自杀基因，又称为前体药物转换酶基因，转移至靶细胞后，可将某些无毒性的前体药物在肿瘤细胞中代谢成毒性产物，从而杀死肿瘤，而携带该基因的受体细胞也被杀死，故称之为“自杀基因”。旁观者效应杀伤未导入基因的邻近分裂的细胞，扩大其杀伤效应单纯疱疹病毒的tk基因（HSV-tk）水痘-带状疱疹病毒的tk基因（VIV-tk）胞嘧啶脱氨酶基因（cytosine deaminase,CD）,70,自杀基因疗法的策略,以HSV-tk基因和CD基因应用最多HSV-tk 催化脱氧胸苷酸外，还能催化前药物GCV(gancilovir)磷酸化，产生明显的细胞毒性，抑制细胞内DNA聚合酶的作用。CD是某些细菌表达的脱氨酶，哺乳动物细胞内无此基因。该酶可将无毒性的前体药物5Fc代谢为常用的化疗药物5-Fu。体内转变为FdUMP，是胸苷酸合成酶的抑制剂，抑制细胞DNA合成。,71,转基因肿瘤疫苗疗法,机体抗肿瘤的免疫必须依赖于肿瘤细胞的抗原被机体免疫系统识别，方能激活。人类肿瘤免疫原性弱，且抗原呈递中存在多个环节缺陷，使肿瘤逃避机体免疫识别。将细胞因子或免疫相关基因导入肿瘤细胞制备肿瘤疫苗，可增强肿瘤细胞抗原性以及抗体对肿瘤抗原的识别和呈递能力，增强机体抗肿瘤免疫能力。肿瘤细胞导入免疫相关MHC基因，提高抗原呈递能力细胞因子基因（IL、TNF、GM-CSF）导入肿瘤细胞,72,感染性疾病的基因治疗,73,引入治疗基因来抑制病原繁殖方法:Anti-sense RNARibozyme,感染性疾病的基因治疗,74,抗病毒基因治疗策略,基因修饰和基因失活是常用的策略抗病毒感染的主要矛盾是机体对病毒的免疫力和病毒对机体的致病力相互之间的对抗。基因修饰技术将抗病毒基因导入人体进行表达基因失活技术则是根据：病毒感染性疾病，病毒本身对细胞的损伤作用一般情况下不是重要的原因，而是病毒复制和表达产物对机体来说是很强的抗原物质，引发机体对感染细胞的免疫应答效应所致，因此从分子水平上抑制病毒基因的复制和表达是有效的治疗,75,抗病毒基因修饰策略,将编码细胞因子，特别是在免疫调节中起重要作用的淋巴因子的基因，导入机体进行表达。常用的是干扰素、白细胞介素、集落刺激因子（GMCSF，GCSF，MCSF）淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activeated killer, LAK）受到广泛重视,76,反 义 RNA 疗 法,反义RNA：指与mRNA互补的RNA分子，可与对应的 RNA分子特异性结合，从而抑制该RNA的 加工和翻译。,AAA,反义RNA,用途：抗肿瘤、抗病毒感染,77,例：艾滋病的防治,HIV - 20世纪的瘟疫 -由于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，特异性破坏CD4+细胞，使机体发生免疫缺陷，造成机体发生肿瘤、机会性感染的一种致死性疾病。HIV属于逆转录病毒，其中HIV-I型是引起全球AIDS流行的主要病源。HIV的基因结构和组合形式与其他的逆转录病毒相似，均是5LTR,gag,pro,pol,env和3LTR，此外，尚有多个调节基因（tat,rev,nef,vif,vpu,vpr,vpx,tev）。,78,HIV的反义核酸基因治疗,靶序列：tat,rev,nef,vpu,gag及5端的引物结合序列等。载体：逆转录病毒；腺相关病毒靶细胞：CD4+细胞（体外） 直接体内转导效果评价： Chatteriee等将与HIV-1 LTR序列互补的长度为63bp的寡核苷酸序列与腺相关病毒载体构建重组体，将其导入T细胞系中，结果显示转化细胞在HIV-I感染后，其病毒滴度下降1000倍。,79,基因治疗现状,至2002年9月为止，在全世界范围内已开展基因治疗636例，其中美国进行的最多。,80,基因治疗存在的问题与伦理学,随着科学技术的发展，基因治疗虽然前景光明，但是在研究与实践中存在许多不容回避的重要问题。,81,外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。化学和物理方法所导人的基因效率低；选择适当的受体细胞；反转录病毒载体介导基因导入，只能对分裂状态时的细胞进行转染，因此采取如 5-FU处理，使细胞分裂增强，再用含有目的基因病毒颗粒转染可获较好效果。,1、导入基因的稳定高效表达,82,2导入基因的安全性,基因治疗的安全性应确保不因导人的外源目的基因而产生新的有害遗传变异。因此，应构建相对安全的反转录病毒载体。至于引起插入突变可能失活一个重要基因，或更严重的是激活一个原癌基因，这个问题的危险程度到底有多大目前仍下甚清楚。,83,安全性的另一个主要方面就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已成功，这就是转基因动物的出现。这一事实既给人类生殖细胞基固治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传，将给人类带来的是福还是祸。因此，许多科学家不仅对此恃慎重态度，还有的持反对态度，也就是基因治疗可能具有的潜在危险性。,84,3基因治疗与社会伦理道德,体细胞基因治疗在伦理道德方面是不存在任何问